一种高纯果果二糖单体的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种高纯果果二糖单体的制备方法，属于分离提纯技术领域。本发明专利技术提供一种高纯果果二糖单体的制备方法，通过酶解法快速提高菊粉或菊粉来源低聚果糖中果果二糖的比例，同时降低同分异构体蔗糖的比例，利用制备高效液相色谱技术分离得到纯度98％以上的符合标准样品要求的果果二糖单体。本发明专利技术的制备方法分离时间短，制备量大，可以放大生产，回收率高，得到目前为止纯度最高的果果二糖单体。

A preparation method of high purity fructose disaccharide monomer

【技术实现步骤摘要】
一种高纯果果二糖单体的制备方法
本专利技术涉及一种高纯果果二糖单体的制备方法，属于分离提纯

技术介绍
低聚果糖，分为蔗糖来源低聚果糖和菊粉来源低聚果糖，具体为果糖基经β-糖苷键连接，末端带有α-D-葡萄糖基、聚合度为3～9，或不带有α-D-葡萄糖基、聚合度为2～9的功能性低聚糖。低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)天然存在于菊苣、牛蒡、蜂蜜、香蕉等多种植物当中。低聚果糖作为益生元的代表，具有润肠通便、增强免疫力、抗龋齿、促进矿物质的吸收、改善肠道菌群、调节微生态平衡的生理功能。菊粉来源低聚果糖包括蔗-果型(GFn)低聚果糖和果-果型(Fn)低聚果糖。果果型低聚果糖(Fn；F为果糖基)的化学结构是2～10个果糖基经β(2→1)糖苷键相互连接而成的果果二糖(F2)、果果三糖(F3)、果果四糖(F4)、果果五糖(F5)、果果六糖(F6)、果果七糖(F7)、果果八糖(F8)、果果九糖(F9)等组分，主要来源为菊粉经内切型菊粉酶作用，从菊粉分子内部随机切断糖苷键，得到不同聚合度果果型低聚果糖及少量蔗果型低聚果糖。低聚果糖在2000年通过美国FDA审核作为公认安全级(GRAS)的功能性低聚糖，由于FOS具有优异的生理学功能，成为近十年来医药、临床营养、保健等领域上广泛流行的功能性基料，应用范围多达500余种保健食品和药品、食品等，市场前景广阔。然而缺乏有效的检测手段，特别是缺少相应的果-果型(Fn)低聚果糖的商业化标准样品，难以精准检测菊粉来源低聚果糖原料及其在食品、保健食品等产品中的含量，一定程度上影响菊粉来源低聚果糖的推广。目前商业化的低聚果糖单体均为蔗-果型(GFn)低聚果糖(如蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等)，缺少高纯的果-果型(Fn)低聚果糖单体。因此，果-果型(Fn)低聚果糖单体的研制将有效解决菊粉来源低聚果糖检测的瓶颈问题，对整个低聚果糖行业起到重要的推动作用。目前，果-果型(Fn)低聚果糖单体的研究或专利不多，主要涉及果果三糖、果果四糖等聚合度为3以上的果-果型(Fn)低聚果糖产品的制备。中国专利CN106543239A采用两次凝胶过滤色谱柱的高效液相色谱法制备纯度大于95％的果果三糖(F3)、果果四糖(F4)和40％的果果五糖(F5)。中国专利CN106632526A采用聚丙烯酰胺凝胶柱分离得到F3、F4、F5、F6、F7、F8或F9的果-果型(Fn)低聚果糖，纯度也仅大于95％。两专利制备所得果-果型(Fn)低聚果糖还没法作为高纯度对照品甚至标准样品使用。果果二糖作为果-果型(Fn)低聚果糖之一，目前尚未见到高纯度果果二糖单体制备的报道。果果二糖在菊粉来源低聚果糖中的含量约为0.5％～3％，而在菊粉中含量则更低(通常少于1％)，远低于菊粉来源低聚果糖中果果三糖和果果四糖的含量，若使用上述专利方法富集果果二糖，制备效率太低，且纯度均不高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种高纯果果二糖单体的制备方法，该制备方法可解决原料中果果二糖比例低、难以富集的问题，同时可实现高纯度(98％以上)的符合标准样品要求的果果二糖单体的分离制备。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种高纯果果二糖单体的制备方法，包括以下步骤：(1)将菊粉或菊粉来源低聚果糖样品加水溶解，得到样品溶液；(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，加热灭酶，滤膜过滤，得到样品酶解溶液；(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分，得到二糖洗脱液；(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分，得到果果二糖洗脱液；(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。本专利技术使用酶解法提高菊粉或菊粉来源低聚果糖原料中果果二糖的比例，同时降低同分异构体蔗糖比例，降低果果二糖和蔗糖的分离难度。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，菊粉的聚合度为2～60，菊粉来源低聚果糖的聚合度为2～9。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，菊粉溶液的质量浓度为5％～25％，菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为10％～50％。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述菊粉溶液的质量浓度为10％～20％，所述菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为20％～30％。菊粉溶液的质量浓度从溶解速度和液体流动性考虑，优选小于20％，从提高底物浓度来考虑，优选大于10％。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，菊粉酶的用量为5～100U/g菊粉或5～20U/g菊粉来源低聚果糖，pH值为3～7，酶解温度为40～70℃，酶解时间为2～24h。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述菊粉酶的用量为20～60U/g菊粉或10～15U/g菊粉来源低聚果糖，所述pH值为4～6，所述酶解温度为50～60℃，所述酶解时间为5～10h。该条件下，反应时间合适，反应时间过快不利于检测，反应时间过慢则效率低下。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，灭酶温度为80～100℃，灭酶时间为10～30min，滤膜的孔径为0.45μm。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，一次制备高效液相色谱法的色谱条件为：低分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～80)：(30～20)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。低分离度HILIC色谱柱优选为Xmide色谱柱。使用低分离度HILIC色谱柱的高效液相色谱法，快速分离不同聚合度糖组分，获得只含果果二糖或同时含有果果二糖和蔗糖的二糖组分。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，二次制备高效液相色谱法的色谱条件为：高分离度HILIC色谱柱，流动相为体积比为(70～85)：(30～15)的乙腈和水混合溶液，柱温为20～40℃，流动相速度为3～10mL/min，进样的质量浓度为10％～20％，进样量为100～300μL。高分离度HILIC色谱柱优选为AsahipakNH2P色谱柱。使用高分离度HILIC色谱柱的高效液相色谱法，精准高效分离果果二糖和蔗糖，获得高纯度果果二糖单体。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，所述低分离度HILIC色谱柱和所述高分离度HILIC色谱柱的规格为10×250mm，20×250mm，30×250mm或以上，粒径为5μm。作为本专利技术所述制备方法的优选实施方式，步骤(4)所述的二次制备高效液相色谱法分离的使用与否，取决于步骤(2)的样品酶解溶液中果果二糖(F2)在二糖(F2和GF)组分中的比例；进一步地，样品酶解溶液中果果二糖(F2)在二糖(F2和GF)组分中的比例≥98％本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高纯果果二糖单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)将菊粉或菊粉来源低聚果糖样品加水溶解，得到样品溶液；/n(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，加热灭酶，滤膜过滤，得到样品酶解溶液；/n(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分，得到二糖洗脱液；/n(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分，得到果果二糖洗脱液；/n(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。/n

【技术特征摘要】
1.一种高纯果果二糖单体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菊粉或菊粉来源低聚果糖样品加水溶解，得到样品溶液；
(2)利用菊粉酶对样品溶液进行酶解，加热灭酶，滤膜过滤，得到样品酶解溶液；
(3)样品酶解溶液经一次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集糖聚合度为2的馏分，得到二糖洗脱液；
(4)二糖洗脱液经二次制备高效液相色谱法分离，利用示差折光检测器或蒸发光散射检测器色谱响应信号，收集果果二糖馏分，得到果果二糖洗脱液；
(5)将收集的果果二糖洗脱液减压冷冻浓缩、干燥，得到高纯果果二糖单体。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菊粉的聚合度为2～60，菊粉来源低聚果糖的聚合度为2～9。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菊粉溶液的质量浓度为5％～25％，菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为10％～50％。


4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菊粉溶液的质量浓度为10％～20％，所述菊粉来源低聚果糖溶液的质量浓度为20％～30％。


5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，菊粉酶的用量为5～100U/g菊粉或5～20U/g菊粉来源低聚果糖，pH值为3～7，酶解温度为40～70℃，酶解时间为2～2...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪维，吴少辉，魏远安，杨新球，吴嘉仪，叶伟娟，霍金洪，
申请(专利权)人：量子高科中国生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44