一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于分析化学技术领域，具体涉及一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用，该检测分析方法利用基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂，虚拟磁性表面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测对神经鞘氨醇己三糖苷进行检测。该衍生试剂的结构式为：

A multichannel mass spectrometry derivatization reagent for the determination of hexylsphingosine and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用
本专利技术属于分析化学
,具体涉及一种检测神经鞘氨醇己三糖苷的多通道质谱衍生试剂及其制备方法与应用，尤其是涉及利用基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂进行标记衍生，虚拟磁性表面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的高通量分析方法。
技术介绍
随着医学的发展和进步,人们对罕见病的重视程度有了极大的提高。法布里病是由α-半乳糖苷酶A缺乏引起的X连锁的溶酶体贮积症，该缺陷导致鞘糖脂的积聚，主要是神经酰胺己三糖苷(globotriaosylceramide,Gb3)和神经鞘氨醇己三糖苷(globotriaosylsphingosine,lyso-Gb3,CASNO.:126550-86-5)贮积在人体的血管、神经、肾脏、心脏等组织器官,引起相应组织器官的结构和功能障碍。临床表现呈现多样性：肢端疼痛、血管角质瘤、肾功能衰竭、心室肥厚、焦虑抑郁等，若不加以重视，极易漏诊、误诊。然而血浆中Gb3的浓度不能明显地与正常受试者区分，大多数经典法布里病患者都可以通过血浆中升高的lyso-Gb3来辨别，因此准确定量lyso-Gb3可以用作临床检验的诊断指标。然而，实际检测样品中存在严重的基质干扰，且健康受试者的血浆lyso-Gb3浓度极低，建立一种高灵敏度、高准确度的检测分析方法是十分必要的。Breemen等人(BiochimicaetBiophysicaActa,2011,1812:70-76)公开了一种利用邻苯二甲醛作为衍生化试剂，通过高效液相色谱-荧光法对血浆中的lyso-Gb3分析检测的方法，但该方法血浆样品处理过程复杂，衍生后直接进行色谱-荧光检测，血浆样品中可能含有其他干扰lyso-Gb3检测的邻苯二甲醛反应性化合物，并且该方法的检测限高、灵敏度低；Gold等人(ClinicalChemistry,2013,59:547-556)公开了一种利用13C5-lysoGb3作内标物，结合超高效液相色谱串联质谱法检测血浆中lyso-Gb3的分析方法，但是稳定同位素内标物并非全部商业化并且购买昂贵，自合成条件苛刻，并且合成物纯度决定定量结果的准确度。因此，继续开发一种高灵敏度、高准确度的分析方法具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有检测技术的不足，首次设计合成了一种基于左氧氟沙星(LFC)的多通道质谱衍生试剂。本专利技术还提供了一种上述基于左氧氟沙星(LFC)的多通道质谱衍生试剂的制备方法。本专利技术还提供了一种利用上述多通道质谱衍生试剂在检测神经鞘氨醇己三糖苷中的应用，通过内标法定量，建立一种高通量、高灵敏度、高准确度、高特异性的虚拟磁性表面分子印迹萃取联合超高效液相色谱三重四极杆质谱检测的分析方法。一次液质联用进样可同时实现8个实际样品的准确定量分析，提高准确度的同时大大缩短了分析时间。本专利技术为了实现上述目的所采用的技术方案为：本专利技术提供了一种基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂，所述试剂的结构式为：所述R为CH3、CH2D、CHD2、CD3、13CD3、C2H5、C2H3D2、C2H2D3或C2D5。本专利技术还提供了一种上述多通道质谱衍生试剂的制备方法，包括以下步骤：a.将1.5g左氧氟沙星溶于100mL色谱乙腈中，超声处理2分钟，加入10.038g碳酸氢铵、48.6mmolCH3I、CH2DI、CHD2I、CD3I、13CD3I、C2H5Br、C2H3D2I、C2H2D3I或C2D5I，放入磁子后密封，在室温下搅拌150小时。抽滤得到的固体在50℃的真空烘箱中干燥7-8h，得白色固体；b.取0.5g白色固体溶解在5mL新蒸的氯化亚砜中，磁力搅拌，升温至80℃，回流4h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得到的红色固体即为CH3-LFC-Cl、CH2D-LFC-Cl、CHD2-LFC-Cl、CD3-LFC-Cl、13CD3-LFC-Cl、C2H5-LFC-Cl、C2H3D2-LFC-Cl、C2H2D3-LFC-Cl或C2D5-LFC-Cl。C3H7-LFC-Cl的合成方法与上述9种质谱衍生试剂的合成过程相似，不同在于，a步骤中使用C3H7Br。本专利技术还提供了一种利用上述基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂检测神经鞘氨醇己三糖苷的方法，包括以下步骤：将9个基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂对目标物进行衍生反应：其中CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为质谱定量的内标物，其余8个衍生试剂CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl分别标记8个实际样品；C3H7-LFC-Cl与lyso-Gb3的合成产物作为虚拟模板用于磁性表面分子印迹材料的合成，利用虚拟磁性表面分子印迹材料对上述9个衍生物进行萃取，洗脱液经滤膜过滤后联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。本专利技术提供的检测方法具体包括以下步骤：a.标记衍生化过程：取50μL标准品溶液或待测样品，加入含有200μLpH8.5-10.5硼酸钠缓冲溶液的离心管中，分别注入200μL55-70μM的CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生，其中CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为内标物，摇匀后密封，在温度37-40℃水浴中超声波振荡反应1-4分钟；b.萃取过程：从上述9份样品中各吸取100μL溶液于离心管中均匀混合，加入200μLpH7.5-9的硼酸钠缓冲溶液、8-15mg虚拟磁性表面分子印迹材料，摇匀后密封，在室温下剧烈震荡10-20分钟，最后用外部磁铁实现分离，加入200μL解吸附溶液进行洗脱2-4分钟；c.将步骤b中的洗脱液经滤膜过滤后定容至200μL后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定量分析检测。本专利技术检测过程中，所使用的虚拟磁性表面分子印迹材料通过以下方法制备而成：a.1g六水合三氯化铁，2g无水乙酸钠和6.5g1,6-己二胺在剧烈搅拌下依次分散在30mL乙二醇中，室温下连续搅拌30分钟。将上述溶液转移到聚四氟乙烯高压釜中，200℃反应24小时。所得产物用水和乙醇各洗三次，60℃下真空干燥24小时，得到的黑色固体为Fe3O4@NH2；b.100mgFe3O4@NH2，200mg4-甲酰基苯硼酸和250mg氰基硼氢化钠分散在25mL无水甲醇中，超声处理20分钟，65℃下回流24小时，水和甲醇各洗三次，60℃下真空干燥24小时，得到的黑色固体为Fe3O4@NH2@FPBA；c.0.4mglyso-Gb3，10mL二氯甲烷和20μL吡啶在冰浴中均匀混合，0.3587mgC3H7-LFC-Cl溶解于10mL二氯甲烷中，倒入恒压漏斗，缓慢滴加到反应瓶中，2小时后移开冰浴，室温下继续搅拌2小时，添加5mLpH9.5的碳酸钠缓冲液反应0.5小时，过滤以获得固体产物：C3H7-LFC-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂，其特征在于，所述试剂的结构式为：/n

【技术特征摘要】
1.一种基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂，其特征在于，所述试剂的结构式为：

；
所述R为CH3、CH2D、CHD2、CD3、13CD3、C2H5、C2H3D2、C2H2D3或C2D5。


2.一种如权利要求1所述的多通道质谱衍生试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将1.5g左氧氟沙星溶于100mL色谱乙腈中，超声处理2分钟，加入10.038g碳酸氢铵、48.6mmolCH3I、CH2DI、CHD2I、CD3I、13CD3I、C2H5Br、C2H3D2I、C2H2D3I或C2D5I，放入磁子后密封，在室温下搅拌150小时；
抽滤得到的固体在50℃的真空烘箱中干燥7-8h，得白色固体；
b.取0.5g白色固体溶解在5mL新蒸的氯化亚砜中，磁力搅拌，升温至80℃，回流4h，减压蒸除氯化亚砜，冷却至室温，得到的红色固体即为CH3-LFC-Cl、CH2D-LFC-Cl、CHD2-LFC-Cl、CD3-LFC-Cl、13CD3-LFC-Cl、C2H5-LFC-Cl、C2H3D2-LFC-Cl、C2H2D3-LFC-Cl或C2D5-LFC-Cl；
C3H7-LFC-Cl的合成方法与上述9种质谱衍生试剂的合成过程相似，不同在于，a步骤中使用C3H7Br。


3.一种利用权利要求1或2所述的基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂检测神经鞘氨醇己三糖苷的方法，其特征在于，包括以下步骤：将9个基于左氧氟沙星的多通道质谱衍生试剂对目标物进行衍生反应：其中CH3-LFC-Cl与神经鞘氨醇己三糖苷(lyso-Gb3)的衍生物作为质谱定量的内标物，其余8个衍生试剂CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl分别标记8个实际样品；C3H7-LFC-Cl与lyso-Gb3的合成产物作为虚拟模板用于磁性表面分子印迹材料的合成，利用虚拟磁性表面分子印迹材料对上述9个衍生物进行萃取，洗脱液经滤膜过滤后联合超高效液相色谱三重四极杆串联质谱系统进行分析检测。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
a.标记衍生化过程：取50µL标准品溶液或待测样品，加入含有200µLpH8.5-10.5硼酸钠缓冲溶液的离心管中，分别注入200µL55-70µM的CH3/CH2D/CHD2/CD3/13CD3/C2H5/C2H3D2/C2H2D3/C2D5-LFC-Cl进行标记衍生，其中CH3-LFC-Cl与lyso-Gb3的衍生物作为内标物，摇匀后密封，在温度37-40℃水浴中超声波振荡反应1-4分钟；
b.萃取过程：从上述9份样品中各吸取100µL溶液于离心管中均匀混合，加入200µLpH7.5-9的硼酸钠缓冲溶液、8-15mg虚拟磁性表面分子印迹材料，摇匀后密封，在室温下剧烈震荡10-20分钟，最后用外部磁铁实现分离，加入200µL解吸附溶液进行洗脱2-4分钟；
c.将步骤b中的洗脱液经滤膜过滤后定容至200µL后利用超高效液相色谱三重四极杆质谱系统进行定量分析检测。


5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述虚拟磁性表面分子印迹材料通过以下方法制备而成：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵先恩，胡静雯，朱树芸，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：山东;37