一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法，以及一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的组合物或试剂盒，包括核苷酸序列的引物和/或探针。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法
本专利技术涉及一种基于荧光定量PCR技术区分人源DNA的方法，以及检测引物和探针。
技术介绍
近年来，随着细胞类药物的快速发展，越来越多的细胞正被开发成细胞治疗药物，逐步从科研走向临床，细胞治疗是新药研发的趋势。细胞治疗类药物，研究其在体内药代动力学是判断其疗效和毒副作用不可或缺的环节。不同于传统的化学药物，对于细胞药物进入机体后的动态变化规律，包括其吸收、分布、代谢和排泄的过程和特征，目前国际上尚未能建立明确的细胞药物在体内药代动力学的研究方法。非临床药代动力学研究，特别是动物实验，在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。通过研究其在体内的动态，预测治疗中的合适计量，对降低细胞治疗的不确定性、增加疗效和减少毒副作用，都有很大的帮助。要将动物实验的结果作为一种评估细胞产品治疗效果的方法，将其与临床效果联系起来，势必需要找到一种灵敏度高且经过充分验证的方法来量化细胞产品在动物模型中的分布。与实验鼠、兔相比，实验猴在新药研究领域是一种非常重要的实验动物，因其与人的高度相似性，实验猴被认为是进行药物评价的重要工具。细胞药物在应用到人体之前，在与人亲缘关系比较相近的动物中进行比较系统的评价是有必要进行的。目前研究细胞在实验猴中分布的方法主要有动物活体成像、荧光蛋白标记、免疫组化、qPCR等。各种方法各有其优缺点。例如核磁共振(MRI)，MRI能反应细胞在体内的分布，该方法需要在体外标记细胞，通过成像的方式对注入机体内的细胞进行检测，从而判定细胞的存活及被清除的命运，该方法灵敏度高，标记时间长。但某些标记手段可能对细胞活性有影响，有报道称MRI标记骨髓间充质干细胞后，细胞分化能力受损。而且MRI灵敏度相对不足，原因是，在细胞死亡后释放出的氧化铁颗粒(MRI标记物)，会造成非特异性显影，出现假阳性。例如绿色荧光蛋白标记(GFP)，该方法使用基因修饰，使得细胞能够表达荧光蛋白，绿色荧光信号可以通过荧光显微镜直接观察，该方法有易于检测的优点。但细胞的遗传物质被改变，无法确保这种改变百分百稳定。任何对细胞进行标记的方法都有可能对细胞造成改变，对子代细胞分化等造成影响。免疫组化的方法，不需要标记细胞，但该方法需要分析大量切片和微观观察，同时由于人与猴的相似性，很多抗原在人与猴之间存在交叉，且这种方法难以标准化，只能得到半定量结果。qPCR的方法是一种灵敏度高，操作相对简单的方法，且有望实现定量分析。要想建立qPCR的方法，通过检测血液和组织样本中DNA来实现人源细胞在实验猴中的定量分析，首先要找到能够区分人与动物模型DNA的序列、以及引物。虽然文献中指出了一些人和猴某些特定基因表达的差异，但是由于实验用的细胞注射到猴以后，细胞可能分化成不再表达该特定基因的细胞，因此目前区分人和猴的细胞的基因会存在假阴性。即人细胞存在于猴组织中，但是其不能被检测出来。例如基于人源性特殊基因片段-Alu基因作为分子标志物设计的引物，希望通过qPCR的方法来实现人与猴DNA的区分，最终实现在猴细胞或组织中检测人细胞的目的。遗憾的是，这些引物只能区分人与啮齿动物。例如2012年PengyueSong等报道了，基于DNA特异性引物的高效可重复PCR方法，能够检测小鼠组织中异种移植的人细胞。2015Julie等发表文章，报道了采用qPCR测定大鼠和小鼠中移植人细胞数量的方法。但鲜少有文章报道，能通过qPCR的方式区分人与猴DNA。
技术实现思路
一方面，本专利技术公开了一种DNA序列，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组，所述DNA序列用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。SEQIDNO:1的序列为：tttaaaaacctccctatcacctccgatcactgttgaaaaagcattaaactgtaagaaggggttagtattgggggaagcatgtcgtttctaaggatgggaaaggaaaatgaagtgcttctcctccctgatccaagagaggcagcttcatgaaacttctgtatgaaaatgggagcgtctgtaggaagagggactctatttacataac另一方面，本专利技术提供了一种DNA序列在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组。本专利技术还提供了一种检测DNA序列的试剂在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组。在一个具体实施例中，所述DNA序列为如SEQIDNO:1所示序列或其反向互补序列，或这些全长序列的一部分片段，所述片段为SEQIDNO:1或其返现个互补序列的5’端和/或3’端缺失1-70个核苷酸的序列，所述片段序列仍可用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。在一个具体实施例中，所述检测DNA序列的试剂选自通过PCR技术扩增所述DNA序列所需的引物和探针。在一个具体实施例中，所述探针的序列如SEQIDNO:10所示。在一个具体实施例中，所述探针上带有检测标记，所述检测标记优选选自由FAM、TET、Alexa488、Alexa532、CF、HEX、VIC、ROX、TexasRed、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texasred、生物素、和亲和素所组成的组。在一个具体实施例中，所述引物的序列选自由如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；如SEQIDNO:4和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列；和如SEQIDNO:4和SEQIDNO:7所示的序列组成的组。在一个具体实施例中，所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。在一个具体实施例中，所述混合人类与非人类动物组织为非人类动物例如恒河猴的组织及血液样本中混合了人源DNA，所述人源DNA来源于人源细胞。在一个具体实施例中，人源DNA来自于人源视网膜色素上皮细胞中的DNA。再一方面，本专利技术公开了一种组合物，包含引物和探针，其中所述探针的序列如SEQIDNO:10所示，所述引物的序列选自由如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；如SEQIDNO:4和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列；和如SEQIDNO:4和SEQIDNO:7所示的序列组成的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种DNA序列，其中所述DNA序列选自如SEQ ID NO:1所示序列或其片段、与SEQ IDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组，所述DNA序列用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。/n

【技术特征摘要】
1.一种DNA序列，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组，所述DNA序列用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA。


2.一种DNA序列在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组。


3.一种检测DNA序列的试剂在制备用于在混有人类与非人类动物组织样本中区分人类和非人类动物DNA的试剂或试剂盒中的用途，其中所述DNA序列选自如SEQIDNO:1所示序列或其片段、与SEQIDNO:1的反向互补序列或其片段组成的组。


4.如权利要求3所述的用途，其中所述检测DNA序列的试剂选自通过PCR技术扩增所述DNA序列所需的引物和探针。


5.如权利要求4所述的用途，其中所述探针的序列如SEQIDNO:10所示。


6.如权利要求5所述的用途，其中所述探针上带有检测标记，所述检测标记优选选自由FAM、TET、Alexa488、Alexa532、CF、HEX、VIC、ROX、TexasRed、QuasarFITC、cy3、cy5、6-joe、EDANS、rhodamine6G、TMR、TMRITC、x-rhodamine、Texasred、生物素、和亲和素所组成的组。


7.如权利要求4所述的用途，其中所述引物的序列选自由如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:2和SEQIDNO:5所示的序列；如SEQIDNO:4和SEQIDNO:3所示的序列；如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示的序列；和如SEQIDNO:4和SEQIDNO:7所示的序列组成的组。


8.如权利要求1所述的DNA序列和如2至7中任一项所述的用途，其中所述非人类动物选自由恒河猴、绿猴、食蟹猴、大鼠、小鼠、兔组成的组。


9.如权利要求1所述的DNA序列和如2至7中任一项所述的用途，其中所述混合人类与非人类...

【专利技术属性】
技术研发人员：方攀峰，冯丽，王志刚，冷晓燕，刘辉，王云娟，
申请(专利权)人：江苏艾尔康生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32