一种食品中牛源性成分PCR-核酸试纸条快速检测方法技术

本发明专利技术公开一种食品中牛源性成分PCR‑核酸试纸条快速检测方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术将核酸检测中的聚合酶链式反应与核酸试纸条检测技术相结合，进行食品中牛源性成分的快速检测。本发明专利技术通过遵循独特设计原则进行引物和探针的设计，真正实现了核酸扩增和杂交在同一反应管中连续进行；最终核酸杂交产物通过一次性核酸试纸条进行可视化读取。该技术具体操作简单、特异性强、灵敏度高等优势，可以用于牛源性成分的快速分子检测。

A rapid detection method of bovine components in food by PCR nucleic acid test strip

【技术实现步骤摘要】
一种食品中牛源性成分PCR-核酸试纸条快速检测方法
本专利技术属于分子生物学领域，一种食品中牛源性成分PCR-核酸试纸条快速检测方法。
技术介绍
随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，肉类产品在居民食品消费中占比逐年升高。然而在利益的驱使下导，肉制品掺假事件频发，从2013年欧洲的“马肉丑闻”，再到2014年国内沃尔玛的“驴肉掺假门”事件，这些肉类食品掺假不仅给消费者带来经济损失，同时影响了消费者的饮食健康。现今食品真伪鉴别和食品质量保证已引起人们的高度重视，确定食物中的肉类种类对社会公平、饮食健康和宗教问题具有重要意义。建立一种准确、快速、灵敏的食品中牛源性检测技术势在必行。目前，基于蛋白质和核酸的检测是食品中动物成分检测的主要方法。蛋白质检测主要有色谱法，电泳法、酶联免疫分析法等；由于蛋白质的热稳定性差，食物在加热和深加工处理后常导致蛋白质变性而无法检出。与蛋白质相比，DNA具有较高的热稳定性和种属特异性，因此，越来越多的检测手段开始着眼于DNA水平检测的研究。常规PCR和实时荧光定量PCR技术由于检测快速、灵敏性高、特异性好等优势，被更多的用于动物物种的检测研究；现有的动物物种基因检测商品化试剂盒也主要是依据以上技术开发的。但无论是常规PCR，还是实时荧光定量PCR技术，对基因扩增产物的检测、分析均需要昂贵的仪器和专业的技术人员；这导致这些技术的应用被限定在专业的实验室，很难满足基层开展动物物种检测的需求。因此，简化PCR产物的检测过程，对加快PCR技术的普及、应用具有重要意义。核酸试纸条检测技术具有简单、快速、可视化等特点，为核酸产物的现场检测提供了新思路。在PCR-核酸试纸条检测技术中，大多数是将PCR的两条引物直接标记上特定的蛋白质或化合物，随后进行PCR扩增，在扩增过程结束后，被标记的PCR产物通过核酸试纸条进行检测。然而，这种双引物直接标记方法，常出现一些干扰因素，如引物的非特异性扩增，另外，引物自身结合产生的引物二聚体也带有同样的标记，从而导致假阳性结果。为了克服引物标记技术的一些缺点，提高检测的特异性，一些研究人员使用特异性标记探针检测核酸产物。但核酸杂交通常需要额外的杂交和温浴过程，从而增加了测试的复杂性，减少了核酸试纸条检测技术的便利性。为了增加核酸传感器检测的便利性，加快PCR-核酸试纸条检测技术的标准化和应用。本专利技术采用独特的引物及探针设计方法，实现了PCR反应和探针杂交在同一反应管连续进行；该方法和检测探针的使用，真正避免了引物直接标记可能带来的假阳性，同时避免了探针的二次杂交过程；为PCR-核酸试纸条技术的推广和应用提供了新技术方案。本专利技术根据独特的引物及探针设计原则，以牛源性成分的快速检测为研究对象，建立了一种食品中牛源性成分快速检测方法。该方法保留了PCR技术的高灵敏性，大大简化了现有PCR-电泳法的检测步骤，同时较实时荧光定量PCR检测技术，其检测成本大大降低。该技术有望成为一种新型的物种成分快速分子检测工具，在牛源性成分检测、掺假鉴定及物种溯源过程发挥重要作用。
技术实现思路
本专利技术旨在将抗原或半抗原小分子标记单链寡核酸作为探针，与待检的靶核酸特异性结合，形成复合物分子同时具备两种抗原或半抗原标记，该复合物即可用与试纸条上特异抗体或特异配体结合，实现核酸扩增产物的核酸试纸条检测。为简化PCR-核酸试纸条技术的检测过程，实现PCR和核酸分子杂交在一个反应管中连续进行。本专利技术中的引物和探针设计中需遵循以下原则：首先，为确保探针与PCR产物有效杂交，由引物扩增产生的PCR产物不应具有复杂的二级结构。PCR产物二级结构可利用FoldWebServe(http://kinefold.curie.fr/)在线评估。若评估中发现PCR产物中存在复杂的二级结构，理论上该区域不适合于进行引物的设计；因此，需要根据牛线粒体基因组的其它保守区重新进行引物设计。并对重新设计的引物对应的PCR产物的二级结构进行评价，若PCR产物不存在复杂的二级结构，则该区域可用于PCR引物设计。其次，引物确定后，可进行特异性探针的设计。为了避免由于两个标记物的特异性探针之间的自身结合而产生假阳性结果，两条探针间互补碱基形成的二级结构的自由能（|ΔG|)绝对值应尽可能小，该参数通过Oligo7软件进行评价。最后，使用DNAStar软件对候选引物和探针的物理参数进行评估。使用BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对引物和探针的特异性进行验证。根据以上原则，本专利技术提供一种PCR-核酸试纸条法检测食品中牛源性成分的的检测技术，主要包括：1、牛源性PCR检测技术：设计两条高度特异的扩增引物：上游引物：5′-GCATCTACCCTGGTCACAAA-3′，下游引物：5′-GTGGTCTTTATTAATTGGTGTTGTG-3′；在适宜的扩增条件下可扩增牛线粒体基因组长度为143bps的DNA片段；设计独特的双探针：探针一：5′-GCATAATCCTATTT-Fam-3′，探针二：5′-Biotin-CGAGTAATTTCTATA-3′。为便于后续检测。以上探针分别经Fam和Biotin标记。PCR反应条件为：95°C预变性5min，95°C变性30sec；56°C退火30sec；72°C延伸30sec，扩增40个循环；95°C变性1min，41°C杂交1min。2、核酸试纸条的制备：本专利技术提供的核酸试纸条（如图1），其结构包括，1：样品垫；2：金标结合物垫；3：塑料底板；4：硝酸纤维素膜；5：吸水垫；6：检测线；7：质控线。将链霉亲和素（SA）与胶体金颗粒（AuNPs）交联形成AuNPs-SA复合物，饱和铺于试纸条的金标垫上。将浓度为1.0mg/mL的鼠抗Fam单克隆抗体和浓度为1.0mg/mL的BSA-Biotin分别固定于硝酸纤维素膜的检测线和质控线。3、本专利技术的PCR-核酸试纸条技术的检测：检测原理如图2。PCR扩增后，PCR扩增产物在95°C保持1min，双链DNA分子变性形成单链DNA。这些单链DNA与特异探针在41°C下形成杂交复合物(被Biotin和Fam标记)，如图2a。将含有该杂交复合物的反应液滴在试纸条的样品垫上，然后将试纸条的下部吸水垫放置于展开液中。在展开液的驱动下，杂交复合物与传感器样本垫上的胶体金-链霉亲和素（AuNPs-SA）共轭结合，形成新的复合物，该复合物在NC膜迁移，并被T线上包被有鼠抗Fam单克隆抗体捕获，T线呈肉眼可见的红色条带。过量的AuNPs-SA继续向上层析，被包被共轭物被有生物素的C线捕获，此时C线呈红色，如图2b。当T线和C线均呈肉眼可见的红色条带时，检测结果呈阳性。当仅C线呈红色条带，结果为阴性。PCR结束后，取5微升的PCR产物上样与试纸条的样品垫，随后将试纸条的下部样本垫插入100微升的展开液(0.01MPBS,pH7.4)；结果在2-3分钟内肉眼读取。有益效果由于本专利技术是以独特设计的引物及探针实现了目本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.本专利技术提供一种食品中牛源性成分PCR-核酸试纸条快速检测方法。/n

【技术特征摘要】
1.本发明提供一种食品中牛源性成分PCR-核酸试纸条快速检测方法。


2.如权利要求1所述的检测方法，采用独特设计的特异性引物进行PCR扩增，其中上游引物：5′-GCATCTACCCTGGTCACAAA-3′，下游引物：5′-GTGGTCTTTATTAATTGGTGTTGTG-3′；扩增产物与带标记的核酸双探针在同一反应管中进行核酸分子杂交，探针一：5′-GCATAATCCTATTT-Fam-3′，探针二：5′-Biotin-CGAGTAATTTCTATA-3′；以上引物及探针经过PCR反应过程，形成带双标记的三明治样核酸复合物，便于后续检测。

【专利技术属性】
技术研发人员：尹锐，肖明雅，薛健，陈阳，楚海娇，李明东，杨海燕，
申请(专利权)人：吉林市天至生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22