短链脱氢酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及短链脱氢酶及其突变体和应用，具体涉及立体选择性互补短链脱氢酶突变体，所述的突变体是从发酵乳酸杆菌(Lactobacillus fermentum)中挖掘到的野生型的短链脱氢酶(LfSDR1)突变得到的，具体涉及短链脱氢酶突变体和其制备方法以及其作为催化剂催化4R/S‑香芹酮的不对称还原制备立体多样性香芹醇。该方法与现有的化学方法相比，具有操作简单、反应条件温和、对环境友好等优点。

Short chain dehydrogenase mutant and its application

【技术实现步骤摘要】
短链脱氢酶突变体及其应用
本专利技术涉及生物工程
，具体涉及短链脱氢酶LfSDR1突变体及其编码基因，含有所述短链脱氢酶突变体基因的重组表达载体与转化体构建，重组酶的制备方法，以及以突变体为催化剂催化4R/S-香芹酮不对称还原获取立体多样性的香芹醇中的应用。
技术介绍
香芹醇是一种天然的、不饱和的、单环的单贴醇，其以(-)-顺式存在于留兰香油中。香芹醇为无色液体，不溶于水，溶于乙醇等有机溶剂，有类似于绿薄荷或香菜的味道，所以香芹醇作为一种香料应用于化妆品或食品工业。在医药领域，香芹醇已经被证明能够化学预防乳腺癌(Carcinogenesis,1992,13(7),1261-1624.)，以及其衍生物(1R,2R,6S)-3-methyl-6-(prop-1-en-2-yl)cyclohex-3-ene-1,2-diol在动物模型中展示了抗帕金森的活性(JournalofMedicinalChemistry,2011，54(11),3866-3874)。香芹醇拥有两个手性中心(C-2位和C-4位)，存在4种立体异构体:(2R,4R)/(2R,4S)/(2S,4R)/(2S,4S)-香芹醇，但是现阶段商业可获得的香芹醇依旧为几种异构体的混合物，而光学纯的4R/S-香芹酮能够从相应的挥发油中提取出来，因此可以以4R/S-香芹酮为底物，通过高立体选择性的催化剂催化不对称还原羰基，分别得到光学纯度高的4种立体异构的香芹醇。科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。自然界中存在的酮还原酶或醇脱氢酶大多是以符合Prelog规则的立体选择性来催化不对称还原产生一种构型的手性醇，然而在药物及化工合成中，两种构型的醇均是重要的合成中间体，因而限制了酮还原酶或醇脱氢酶在工业中的应用。例如符合Prelog规则的R-2-氯-1-(4-氟苯基)乙醇是合成胆固醇吸收抑制剂的手性中间体；符合反Prelog规则的R-1-(3,5-双三氟甲基苯基)乙醇是合成抗肿瘤辅助用药阿瑞匹坦的手性中间体。近期，游松等通过蛋白质结构及计算机模拟辅助的方法将一些野生型的短链脱氢酶改造成能够针对卤代苯乙酮的非对称还原的、具有立体选择性互补的一些突变体(ACSCatalysis，2018，doi：10.1021/acscatal.8b00807)。本实验室通过基因挖掘获取的来源于发酵乳酸杆菌的短链脱氢酶LfSDR1，野生状态下对4R-香芹酮表现出反Prelog立体选择性(还原产物为2S,4R-香芹醇，非对映体过量值(de)为>99％)，而对4S-香芹酮立体选择性较差。所以通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现不同构型的光学纯的香芹醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。
技术实现思路
：本专利技术目的在于解决现有发酵乳酸杆菌短链脱氢酶(LfSDR1)立体选择性低及立体选择性单一的问题，通过定点突变，获取该酶突变体、编码突变体的核酸、含有该核酸的重组表达载体及重组表达转化体，重组突变体酶催化4R/S-香芹酮不对称还原，制备立体多样性的香芹醇中的应用。为解决上述问题，本专利技术首先采取定点突变的技术，获取立体选择性改变的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白。所述的短链脱氢酶LfSDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。编码所述短链脱氢酶的基因的碱基序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所述的短链脱氢酶LfSDR1的突变体是在SEQIDNo.2的基础上将其92位、141位、146位、186位或206位中的一个位点单独突变或几个位点同时突变。进一步地，本专利技术所述的短链脱氢酶LfSDR1的突变体是在SEQIDNo.2的基础上将其186位突变；或在SEQIDNO.2的基础上将其92位、141位、146位、186位、206位同时突变。进一步地，为了提高野生型对4S-香芹酮的反Prelog立体选择性，对序列表中具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列进行突变，将186位的缬氨酸(V)突变为具有较大空间位阻的色氨酸(W)，从而获取具有羰基还原活性的短链脱氢酶LfSDR1的突变体蛋白LfSDR1-V186W并命名为LfSDR1-M1(SEQIDNo.4)，其催化4S-香芹酮的立体选择性为92.8％(de，2S,4S)。并且LfSDR1-M1催化4R-香芹酮的立体选择性相对于野生型无改变>99％(de，2S,4R)。为了逆转野生型对4R/S-香芹酮的立体选择性，对序列表中具有如SEQIDNO.2所示氨基酸序列进行突变，将92位甘氨酸(G)突变成具有较大空间位阻的丙氨酸(A)，将141位谷氨酸(E)突变成非极性的苯丙氨酸(F)，将146位天冬氨酸(D)突变成非极性的缬氨酸(V)，将186位的缬氨酸(V)突变成空间位阻较小的丙氨酸(G)，将206位赖氨酸(K)突变成非极性的亮氨酸(L)，获取突变体LfSDR1-G92A-E141F-D146V-V186G-K206L并命名为LfSDR1-M2(SEQIDNo.6)，其催化4R/S-香芹酮不对称还原的立体选择性分别为90.0％(de，2R,4R)和40.7％(de，2R,4S)。所述突变体获得方法具体过程如下：为获取LfSDR1-M1和M2的突变体，以野生型短链脱氢酶LfSDR1基因(SEQIDNO.1)为模板，利用含有突变点的突变引物(选取突变点上下游各15-20bp的碱基，将突变点的碱基替换成突变后氨基酸的密码子作为PCR正向引物，其反向互补序列作为反向引物)，通过PCR扩增获得突变体LfSDR1-M1与M2基因。进一步，将突变体基因及载体质粒pET22b以内切酶NdeⅠ与XhoⅠ进行双酶切(37℃反应4-8h)，利用普通DNA产物凝胶回收试剂盒，回收经酶切的核酸片段；以T4DNA连接酶将经过双酶切的突变基因片段及载体质粒片段连接(16℃反应2-6h)获取重组质粒pET22b-LfSDR1-M1与pET22b-LfSDR1-M2；将重组质粒转化入E.coliRosseta(DE3)感受态细胞中，较佳的转化方法为热激法：具体过程为45℃热激90S。将构建的重组转化体细胞经过培养表达突变体短链脱氢酶。具体实施方式：下面结合具体实例对本专利技术进行具体说明。某些术语的定义非对映体过量值(de)定义为对映体混合物中一个非对映异构体A比另一个非对映异构体B多出来的量占总量的百分数，缩写为de，公式为(A-B)/(A+B)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。de值越高，光学纯度也越高。20种氨基酸缩写如下：实施例涉及的培养基配方。a).LB液体培养基：称取10gNaCl，10g胰蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短链脱氢酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种短链脱氢酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。


2.一种编码权利要求1所述的短链脱氢酶的基因，其特征在于，碱基序列如SEQIDNo.1所示。


3.短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQIDNo.2基础上将其92位、141位、146位、186位或206位中的一个位点单独突变或几个位点同时突变。


4.如权利要求3所述的短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQIDNo.2基础上将186位缬氨酸突变为色氨酸，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。


5.如权利要求3所述的短链脱氢酶突变体，其特征在于，在SEQIDNo.2基础上将92位甘氨酸突变成丙氨酸，将141位谷氨酸突变成苯丙氨酸，将146位天冬氨酸突变成缬氨酸，将186位的缬氨酸突变成...

【专利技术属性】
技术研发人员：游松，秦斌，郭继阳，张飞霆，刘贵高，秦凤玉，张文鹤，祝天慧，唐军，闫平泽，张瑞，李衡宇，于召惠，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21