一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用，可以抑制人内皮素受体的功能。本发明专利技术包括这些抗体的制备、克隆、表达和鉴定，本发明专利技术能有效应用于人的肺动脉高压、伴随有肺动脉压升高的疾病和生殖器官癌症的治疗。

An antibody that can specifically bind to human endothelin receptor and its application

【技术实现步骤摘要】
一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用本申请是申请日为2015年12月01日、申请号为201510867288.7、名称为“一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用”的专利技术申请的分案。
本专利技术涉及一种抗体，特别涉及一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体及其应用
技术介绍
内皮素(endothelin，ET)是调节心血管功能的重要因子，对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。它不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中(Barton等,2008,Can.J.Physiol.Pharmacol.86:485-498)。它是由21个氨基酸组成的多肽，分子量为2,400Da，N端是两个二硫键将1-15，3-11位置的半胱氨酸连接起来，C端是一些疏水性氨基酸的残基。N端结构决定其与受体的亲和力，C端结构决定其与受体的结合位置。ET-1另有两个亚型即ET-2，ET-3，其差别在于个别氨基酸的残基，对于心血管起主要作用的是ET-1。内皮细胞受到刺激合成并释放ET-1，其调控主要在基因转录水平。内皮素受体(endothelinreceptors，ETR)有ETAR和ETBR二种，属G蛋白偶联受体(G-proteincoupledreceptor,GPCR)。ETAR活化后通过激活细胞膜上Na+/Ca2+交换体(Na+/Ca2+exchanger,NCX)和Na+/H+交换体(Na+/H+exchanger，NHE)使胞内Ca2+浓度升高和肌纤维对Ca2+的敏感性增加，介导血管平滑肌细胞和心肌细胞收缩(Neylon,1999,Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.26:149-153)。一般来说，ETBR与ETAR的功能相互抗衡，ETBR主要是使血管平滑肌细胞和心肌细胞舒张(Nelson等,2003,Nat.Rev.Cancer3:110-113)。肺动脉高压(pulmonaryarterialhypertension,PAH)由肺内或者与肺关联血管的不断束紧(vasoconstriction)引起心脏对肺供血量不足后，心脏对肺供血压力补偿性增加而引起，其微观表现有肺小动脉内膜增厚，血管紧缩，重构，僵硬或者血栓造成的局部闭塞，进而血管对肺血液循环的阻力上升(Simonneau等,2004,J.Am.Coll.Cardiol.43:5S–12S；Barst等,2004,J.Am.Coll.Cardiol.43:40S–47S)。内皮素受体ETAR抑制剂能够有效的阻断由内皮素引起的血管压力增加来达到缓解肺动脉高压的症状，改善病人的运动能力和血液动力学(Serasli等,2010,RecentPat.Cardiovasc.DrugDiscov.5:184-95)。本专利技术提供了与ETAR受体相结合的抗体，它们可以抑制此受体的信号通路，并被用于单独治疗或者协同治疗肺动脉高压，同时也可以被用于诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，可以抑制人内皮素受体的功能，本专利技术抗体可以应用于肺动脉高压的治疗。ETAR属于GPCR的A家族成员，其有七个跨膜区，胞外区非常短小，只占蛋白全长的1/7，而GPCR的抗体只能针对它的胞外区。因此，由于GPCR本身的结构特点和天然的低表达率，导致有生物学活性的GPCR抗原难以制备。GPCR属于膜蛋白，本身难以纯化，要获得针对GPCR的单克隆抗体，不可能仅靠GPCR的N末端多肽的免疫来制备，一般是通过全细胞和细胞膜的免疫来制备，最后通过全细胞的结合和功能性的实验来鉴定。本专利技术通过特定的细胞膜和全细胞免疫技术，获得了一种针对ETAR的具有抑制性功能的单克隆鼠源抗体，进一步通过人源化获得其人源化抗体，以便用于患者的治疗。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一的氨基酸序列：a.选自以下序列之一的轻链CDR3序列：与选自L1-L12的轻链CDR3序列：SEQIDNO:50、SEQIDNO:52、SEQIDNO:54、SEQIDNO:56、SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68其中之一相差总共不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR3序列；b.选自以下序列之一的重链CDR3序列：与选自H1-H12的重链CDR3序列：SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136其中之一相差总共不超过四个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR3序列；c.方案a的轻链CDR3序列和方案b的重链CDR3序列。作为优选，所述抗体还包含以下方案的一种或几种组合的氨基酸序列：a.选自以下之一的轻链CDR1序列：与选自L1-L12的轻链CDR1序列：SEQIDNO:8、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR1序列；b.选自以下之一的轻链CDR2序列：与选自L1-L12的轻链CDR2序列：SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:42、SEQIDNO:44、SEQIDNO:46、SEQIDNO:48其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的轻链CDR2序列；c.选自以下之一的重链CDR1序列：与选自H1-H12的重链CDR1序列：SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90其中之一相差不超过两个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR1序列；d.选自以下之一的重链CDR2序列：与选自H1-H12的重链CDR2序列：SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114其中之一相差不超过三个氨基酸添加、替换和/或缺失的重链CDR2序列。一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，所述抗体包含以下方案之一：<本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，其包含:/n(a)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:20或SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:24；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:44；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:62；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:84；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:106或SEQ ID NO:108；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:128或SEQ ID NO:130；(b)轻链CDR1氨基酸序列:SEQID NO:26；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:46；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:64；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:86；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:110；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:132；/n(c)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:30；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:48；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:68；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:90；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:114；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:136；/n(d)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:10；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:34；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:52；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:72；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:94；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:118；/n(e)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:12；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:36；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:54；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:74；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:96；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:120；/n(f)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:14；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:38；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:56；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:76；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:98；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:122；/n(g)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:16；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:40；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:58；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:78；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:100；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:124；/n(h)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:18；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:42；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:60；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:80；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:102；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:126；或/n(i)轻链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:28；/n轻链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:46；/n轻链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:66；/n重链CDR1氨基酸序列:SEQ ID NO:88；/n重链CDR2氨基酸序列:SEQ ID NO:112；和/n重链CDR3氨基酸序列:SEQ ID NO:134。/n...

【技术特征摘要】
20141205 CN 20141073966351.一种能与人内皮素受体特异性结合的抗体，其包含:
(a)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:20或SEQIDNO:22或SEQIDNO:24；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:44；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:62；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:82或SEQIDNO:84；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:104或SEQIDNO:106或SEQIDNO:108；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:128或SEQIDNO:130；(b)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:26；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:46；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:64；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:86；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:110；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:132；
(c)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:30；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:48；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:68；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:90；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:114；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:136；
(d)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:10；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:34；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:52；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:72；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:94；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:118；
(e)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:12；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:36；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:54；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:74；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:96；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:120；
(f)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:14；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:38；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:56；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:76；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:98；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:122；
(g)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:16；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:40；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:58；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:78；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:100；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:124；
(h)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:18；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:42；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:60；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:80；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:102；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:126；或
(i)轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:28；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:46；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:66；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:88；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:112；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:134。


2.根据权利要求1所述的抗体，其包含:
轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:20或SEQIDNO:22或SEQIDNO:24；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:44；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:62；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:82或SEQIDNO:84；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:104或SEQIDNO:106或SEQIDNO:108；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:128或SEQIDNO:130。


3.根据权利要求2所述的抗体，其包含:
轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:20；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:44；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:62；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:82；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:104；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:128。


4.根据权利要求2所述的抗体，其包含:
轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:22；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:44；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:62；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:82；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:106；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:128。


5.根据权利要求2所述的抗体，其包含:
轻链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:24；
轻链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:44；
轻链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:62；
重链CDR1氨基酸序列:SEQIDNO:84；
重链CDR2氨基酸序列:SEQIDNO:108；和
重链CDR3氨基酸序列:SEQIDNO:130。


6.根据权利要求1所述的抗体，其包含:
(a)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:140；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:168；
(b)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:142；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:170；
(c)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:144；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:172；
(d)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:146；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:174；
(e)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:148；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:176；
(f)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:150；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:178；
(g)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:152；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:180；
(h)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:154；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:182；
(i)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:156；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:184；
(j)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:158；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:186；或
(k)轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:160；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:188。


7.根据权利要求2所述的抗体，其包含轻链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:150；和重链可变结构域氨基酸序列:SEQIDNO:178。


8.根据权利要求2所述的抗体...

【专利技术属性】
技术研发人员：张成，章华，汪笑峰，药晨江，姜艳，王敏，石欣欣，潘昊，景书谦，
申请(专利权)人：鸿运华宁杭州生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33