一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，包括含有链霉亲和素包被的磁微粒的试剂R1、含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的试剂R2和含有生物素标记的B型利钠肽抗体的试剂R3。本发明专利技术采用双抗体夹心法的原理，利用亲和素‑生物素体系，采用吖啶酯化学发光，大大提高了试剂盒的检测准确度，减少反应时间，降低试剂成本，吖啶酯易于偶联、标记工艺简单，稳定性好，标记后对其发光性能影响少，试剂盒有效期长，成本相对较低，且发光为闪光型，发光快速集中且强大，方便实现快速检测，检测的灵敏度和精密度都很高，对于仪器的要求简单，便于实现全自动化操作，不需要增强剂或者催化剂，干扰因素少，本底极低，信噪比很高。

A chemiluminescence quantitative detection kit for B-type natriuretic peptide in plasma

【技术实现步骤摘要】
一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒
本专利技术涉及免疫分析
，尤其涉及一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒及其制备方法和检测方法。
技术介绍
B型利钠肽(BNP)是近年发现的重要利钠肽家族成员，由32个氨基酸组成，具有一个由17个氨基酸通过一对二硫键组成的环状活性结构。BNP是利钠肽原的蛋白酶裂解产物，利钠肽原含有134个氨基酸残基，在心肌细胞内合成。利钠肽原脱去信号肽(残基1～26)成为利钠肽(proBNP)分子(氨基酸残基27～134)。proBNP(108个氨基酸残基)在转化酶的依赖反应中形成两个多肽，即BNP(氨基酸残基77～108)和proBNP的N端部分(NT-proBNP，氨基酸残基1～76)。BNP和NT-proBNP以及没有分解的proBNP都被分泌到血液中并在血液中循环。在心力衰竭(HF)、急性冠状动脉综合症(ACS)、左心室肥厚、心肌病、心脏瓣膜疾病、心房纤维性颤动和心脏淀粉样变性患者中浓度均有升高。BNP的浓度与疾病的严重程度成正比。因此，BNP检测被广泛用于评价心衰的严重程度。BNP升高也可以见于除心力衰竭之外的多种疾病。在急性冠脉综合征患者中学江BNP水平明显升高，且BNP水平与心肌梗死面积相关，即BNP水平越高，心肌梗死面积越大，因此血浆BNP水平可用于临床评估心肌梗死面积大小；肺部及并入慢性阻塞性肺疾病、肺栓塞、肺动脉高压与BNP亦有相关性，血浆BNP水平在慢性阻塞性肺疾病患者中升高，但是低于急性加重期或者心力衰竭患者，对于呼吸困难病因有一定的鉴别意义，且与预后相关；在肾脏中独立存在的利钠肽系统，BNP水平升高是发生急性肾损伤和死亡的危险因素，因此可以通过检测危重患者血浆BNP水平来预判急性肾损伤的发生和预后。在慢性肾脏病患者中，血浆BNP水平升高与肾脏损伤严重程度呈正相关，血浆BNP可以作为有效的生物标记分子用于检测肾脏损伤进展。此外，肝硬化患者的血浆BNP水平同样值得关注。因此，需要开发出一种检测血浆中B型利钠肽的试剂盒。目前化学发光免疫测定(CLIA)是继酶免技术、放免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫测定技术。化学发光免疫分析是近年来飞速发展，由于它既具有免疫反应的高度特异性，又具有发光反应的高敏感性，近年来已被国内外临床实验室及科研单位广泛应用于各种激素、特种蛋白及药物的监测和分析。该方法具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、试剂稳定性好、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验分析手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高，特异性好，操作简单等优点。本专利技术的又目的是提供一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：本专利技术提供了一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，包括含有链霉亲和素包被的磁微粒的试剂R1、含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的试剂R2和含有生物素标记的B型利钠肽抗体的试剂R3；其中：试剂R1含有链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.01％～1％，所述超顺磁颗粒是以四氧化三铁为内核、表面包裹带有如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)、甲苯磺酰基(Tosyl)或其他易于偶联的活性基团的聚合物，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm；试剂R2含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的浓度≥0.1μg/mL，B型利钠肽抗体与吖啶酯标记物的摩尔比是1:3～1:15；试剂R3含有生物素标记的B型利钠肽抗体的浓度为≥0.5μg/mL，B型利钠肽抗体与偶联标记物生物素的摩尔比为1:3～1:15。其中，试剂R1含有链霉亲和素包被的磁微粒的浓度优选为0.072％。试剂R2含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的浓度优选为0.4μg/mL。试剂R3含有生物素标记的B型利钠肽抗体的浓度优选为2.0μg/mL。本专利技术的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒中，还包括B型利钠肽质控品，所述质控品包括浓度为100pg/mL和2000pg/mL的B型利钠肽抗原溶液。本专利技术的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒中，还包括B型利钠肽校准品，所述B型利钠肽校准品是将BNP纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为0pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、2000pg/mL和5000pg/mL的B型利钠肽标准溶液。本专利技术的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒中，还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括酸性激发液A液和碱性激发液B液，所述A液为过氧化氢和硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。本专利技术还提供了上述检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒的制备方法，其中，试剂R1的制备方法为：将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成R1试剂；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50～100mg/mL；链霉亲和素磁颗粒溶液和Tris溶液的体积比优选为(0.5～1)：(5～10)；所述的混匀时间优选为10～15min，所述的缓冲液为25mMTris、0.02％吐温-20、0.05％Proclin300，pH7.2或50mMBistirs、0.02％吐温-20、0.1％Proclin300，pH6.0。试剂R2的制备方法为：取B型利钠肽抗体，用20mMPB缓冲液置换B型利钠肽抗体保存液，置换方法采用超滤离心法有效提高置换回收率和标记率，并缩短了工作时间，然后用20mMPB缓冲液稀释至1mg/mL，按照抗体与吖啶酯摩尔比1：3～1：15添加吖啶酯，37℃孵育2～4h进行标记，然后加入封闭液，37℃孵育2～4h，然后蛋白纯化仪纯化，收集蛋白峰值，得到吖啶酯标记的B型利钠肽抗体，进一步采用50～100mMBistirs、1～3％BSA、0.1％BGG、0.1％吐温-20、0.5％叠氮钠，pH6.0的缓冲液配制成R2试剂，所述封闭液为含2～5％BSA的20mMPB缓冲液。常见的化学发光体系有多种，最主要的有：HRP-鲁米诺系统、吖啶酯系统、电化学发光体系等。吖啶酯是一类重要的化学发光试剂，具有较高的量子产率，其化学发光效率较高，通常是鲁米诺的五倍或五倍以上。除此之外，吖啶酯的化学发光过程反应迅速，本底低，在氢氧化钠和过氧化氢的存在下即可发光。在氧化反应过程中，结合物被分解，不影响游离吖啶酯的发光；另外，吖啶酯类化学发光试剂具有较好的稳定性，易于储存。吖啶酯在碱性条件下被过氧化氢氧化成N-甲基吖啶酮，由激发态回到基态时释放光子。吸电子基能使亲核进攻过程变易，发光速度加快，从而使量子产率增高。因此，本专利技术采用吖啶酯作为化学发光体系。试剂R3的制备方法为：取B型利钠肽抗体，用20mMPB缓冲液置换B型利钠肽抗体保存液，置换方法采用超滤离心法有效提高置换回本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括含有链霉亲和素包被的磁微粒的试剂R1、含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的试剂R2和含有生物素标记的B型利钠肽抗体的试剂R3；/n其中：/n试剂R1含有链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.01％～1％，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm；/n试剂R2含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的浓度≥0.1μg/mL，B型利钠肽抗体与吖啶酯标记物的摩尔比是1:3～1:15；/n试剂R3含有生物素标记的B型利钠肽抗体的浓度为≥0.5μg/mL，B型利钠肽抗体与偶联标记物生物素的摩尔比为1:3～1:15。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，包括含有链霉亲和素包被的磁微粒的试剂R1、含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的试剂R2和含有生物素标记的B型利钠肽抗体的试剂R3；
其中：
试剂R1含有链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.01％～1％，所述链霉亲和素磁颗粒的粒径是0.05～3μm；
试剂R2含有吖啶酯标记的B型利钠肽抗体的浓度≥0.1μg/mL，B型利钠肽抗体与吖啶酯标记物的摩尔比是1:3～1:15；
试剂R3含有生物素标记的B型利钠肽抗体的浓度为≥0.5μg/mL，B型利钠肽抗体与偶联标记物生物素的摩尔比为1:3～1:15。


2.根据权利要求1所述的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括B型利钠肽质控品，所述质控品包括浓度为100pg/mL和2000pg/mL的B型利钠肽抗原溶液。


3.根据权利要求1所述的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括B型利钠肽校准品，所述B型利钠肽校准品是将BNP纯品用标准品稀释液配制成浓度分别为0pg/mL、20pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL、2000pg/mL和5000pg/mL的B型利钠肽标准溶液。


4.根据权利要求1所述的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括酸性激发液A液和碱性激发液B液，所述A液为过氧化氢和硝酸溶液，B液为氢氧化钠溶液。


5.根据权利要求1所述的检测血浆中B型利钠肽的化学发光定量检测试剂盒，其特征在于，试剂R1的制备方法为：将链霉亲和素磁颗粒溶液和TBST溶液混匀后，放置在磁分离器上，直至上清液无混浊，弃上清，留取磁颗粒，清洗后在缓冲液中配成R1试剂；所述的链霉亲和素磁颗粒溶液的浓度优选为50～100mg/mL；链霉亲和素磁颗粒溶液和Tris溶液的体积比优选为(0.5～1)：(5～10)；所述的混匀时间优选为10～15min，所述的缓冲液为25mMTris、0.02％吐温-20、0.05％...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩美玉，王立英，翟涛，张丹丹，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22