一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法技术

本发明专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O‑糖基化位点的鉴定方法。首先对胰岛素及其类似物进行弹性蛋白酶酶切，通过LC‑MS分析肽图谱，初步确定相应的糖基化肽段；然后对糖基化关键肽段进行Q‑TOF‑MS/MS分析，通过优化关键肽段的CID质谱碎裂能量，得到关键的带糖的碎片离子，从而更准确和简便的分析O糖基化位点。本发明专利技术在常规CID碎裂技术下即可实现复杂肽段的糖基化位点分析和确认，操作简单，准确度高，实用性强，经济，适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪，为糖基化类的翻译后修饰分析以及在蛋白质组学中的应用提供了一种新的思路。

A method for the identification of O-glycosylation sites of insulin and its analogues

【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法。
技术介绍
重组人胰岛素及其类似物是治疗糖尿病不可替代的产品，但在生物制药大规模生产重组产品的过程中，通常会导致蛋白质的翻译后修饰。胰岛素类似物一般用酵母表达系统，在表达的过程中会形成比较常见的O-糖基化修饰。在工艺开发过程中要尽可能的降低O-糖基化修饰的比例，并对O-糖基化的杂质进行结构鉴定。O糖基化修饰一般发生在苏氨酸(T)或者丝氨酸(S)上，胰岛素类产品的氨基酸序列中含有较多的T和S，而O-糖基化位点的鉴定是一个比较大的难题。质谱碎裂方式对于完整O糖肽的鉴定极为重要，直接决定了O-糖基化位点鉴定的成功与否。通常串联质谱中最常用的碎裂技术是CID(collision-induceddissociation)和HCD(higherenergycollisiondissociation)，其基于碰撞能量再分配的基本原理，碎裂肽段中的肽键，产生b、y类型的碎片离子，在肽段序列鉴定中具有很大优势。然而，由于糖苷键键能小于肽本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)用弹性蛋白酶酶切样品；/n(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；/n(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用弹性蛋白酶酶切样品；
(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；
(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:15。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为1～1.5h。


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【专利技术属性】
技术研发人员：龚庆伟，冯艳，蒋燕，封启媛，徐军，谢灿，高相雷，李晓平，陈小锋，李文佳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，东莞东阳光药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44