本发明专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O‑糖基化位点的鉴定方法。首先对胰岛素及其类似物进行弹性蛋白酶酶切，通过LC‑MS分析肽图谱，初步确定相应的糖基化肽段；然后对糖基化关键肽段进行Q‑TOF‑MS/MS分析，通过优化关键肽段的CID质谱碎裂能量，得到关键的带糖的碎片离子，从而更准确和简便的分析O糖基化位点。本发明专利技术在常规CID碎裂技术下即可实现复杂肽段的糖基化位点分析和确认，操作简单，准确度高，实用性强，经济，适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪，为糖基化类的翻译后修饰分析以及在蛋白质组学中的应用提供了一种新的思路。
A method for the identification of O-glycosylation sites of insulin and its analogues
【技术实现步骤摘要】
一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法
本专利技术涉及生物化学领域，具体涉及一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法。
技术介绍
重组人胰岛素及其类似物是治疗糖尿病不可替代的产品，但在生物制药大规模生产重组产品的过程中，通常会导致蛋白质的翻译后修饰。胰岛素类似物一般用酵母表达系统，在表达的过程中会形成比较常见的O-糖基化修饰。在工艺开发过程中要尽可能的降低O-糖基化修饰的比例，并对O-糖基化的杂质进行结构鉴定。O糖基化修饰一般发生在苏氨酸(T)或者丝氨酸(S)上，胰岛素类产品的氨基酸序列中含有较多的T和S，而O-糖基化位点的鉴定是一个比较大的难题。质谱碎裂方式对于完整O糖肽的鉴定极为重要，直接决定了O-糖基化位点鉴定的成功与否。通常串联质谱中最常用的碎裂技术是CID(collision-induceddissociation)和HCD(higherenergycollisiondissociation)，其基于碰撞能量再分配的基本原理，碎裂肽段中的肽键，产生b、y类型的碎片离子，在肽段序列鉴定中具有很大优势。然而，由于糖苷键键能小于肽键，糖基化修饰在CID及HCD碎裂中极易断裂，很难得到含有糖链的碎片离子，因此较难从二级谱图中找到关于多肽糖基化位点的肽段来确定糖基化的位点。电子捕获解离/电子转移解离(ECD/ETD)一般只断裂多肽的骨架，产生c/z离子，与此同时糖链基本保持稳定不断裂，是分析糖基化位点较为便利的手段。VivekanandanKannan等(VivekanandanKannan,etal，AtandemmassspectrometricapproachtotheidentificationofO-glycosylatedglargineglycoformsinactivepharmaceuticalingredientexpressedinPichiapastoris，RapidCommun.MassSpectrom，2009，23:1035-1042)利用ESI-MS确定了糖基化杂质的分子量，再通过Glu-C对相应的杂质进行还原肽图谱分析，经LC-MS连用确定糖基化发生的肽段(A5-A17)，收集糖基化肽段进行MALDI-TOF/TOFMS/MS分析以及ETD碎裂技术证明O糖基化发生在T8位的苏氨酸上。NagarajGovindappa等(NagarajGovindappa,etal，PMT1geneplaysamajorroleinO-mannosylationofinsulinprecursorinPichiapastoris，ProteinExpressionandPurification，2013，88：164-171)通过制备纯化得到重组人胰岛素的单糖基化和双糖基化的杂质，利用ESI-MS得到相应的分子量，再通过Glu-C对相应的杂质进行还原肽图谱分析，经LC-MS连用确定糖基化发生的肽段(A5-A17)，最后通过ETD碎裂技术对该肽段进行MS/MS分析，证明O糖基化发生在T8位的苏氨酸上。两者均是通过ETD碎裂的方式进行MS/MS分析最终得到O糖基化位点。但ETD技术虽然也可以用于糖基化位点的鉴定，但该技术还不是太稳定，应用也没有CID广泛，对于氨基酸个数较多的肽段需要得到比较全的c/z离子，目前只有thermo公司的orbitrapfusion和waters公司的SynaptG2-SQ-TOF可配备ETD模块，ECD只能在傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICRMS)中才能使用，但这两款质谱价格都相当昂贵，价格在500万以上，且购买量相对较少，一般的制药公司或者外包机构都没有这种类型的质谱。而仅仅通过常规的酶切方法，如V8酶酶切肽图，通过LC-MS分析仅能大致确定糖基化在哪个肽段上面，对相关的糖基化肽段进行Q-TOF-MS/MS分析时，因糖基化肽段含有多个潜在的位点且糖苷键容易断裂，所以不能确证糖基化的具体位点。基于上述传统的质谱碎裂方法如碰撞碎裂(CID)会优先碎裂糖链，产生较少的肽段骨架，ECD和ETD的碎裂方式成本又较昂贵，仅仅采用常规的酶切技术无法确证具体的糖基化位点，因此，急需开发一种准确度高、操作简单、成本低和新型的胰岛素及其类似物产品中O糖基化位点鉴定的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种胰岛素及其类似物产品中O-糖基化位点的鉴定方法，所述方法采用弹性蛋白酶对胰岛素及其类似物进行酶切，通过LC-MS分析肽图谱，初步确定产生O-糖基化的糖基化肽段；然后对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，通过优化关键肽段的CID质谱碎裂能量，得到了关键的带糖的碎片离子，从而更准确和简便的分析O糖基化位点。通过本申请的技术方案，在常规CID碎裂技术下即可实现复杂肽段的糖基化位点分析和确认，操作简单，准确度高，实用性强，经济，适用于所有带有CID碎裂技术的质谱仪，为糖基化类的翻译后修饰分析以及在蛋白质组学中的应用提供了一种新的思路。本专利技术的上述技术目的是通过下述技术方案实现：本专利技术提供一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，包括以下步骤：(1)用弹性蛋白酶酶切样品；(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。在本专利技术一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20，弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃，酶切时间为0.5～3h。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:15；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:11～1:13。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切温度为37±0.5℃。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1～1.5h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为1.5h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为2h；在一些实施方案中，所述的弹性蛋白酶酶切时间为3h。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的是碰撞诱导解离CID的碎裂方式。在本专利技术的一些实施方案中，在采用步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS对糖基化样品的关键肽段进行分析时，CID碰撞能量的大小是6～35；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是8～30；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是10～28；在一些实施方案中，碰撞能量的大小是10；在另一些实施方案中，碰撞能量的大小是12；在又一些实施方案中，碰撞能量的大小是27.6。在本专利技术的一些实施方案中，步骤(3)所述的Q-TOF-MS/MS分析采用的色谱条件：色谱柱信息：welc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(1)用弹性蛋白酶酶切样品；/n(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；/n(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。/n
【技术特征摘要】
1.一种胰岛素及其类似物O-糖基化位点的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用弹性蛋白酶酶切样品；
(2)通过LC-MS分析肽图谱，确定相应的糖基化肽段；
(3)对糖基化关键肽段进行Q-TOF-MS/MS分析，确证糖基化的位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:20。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的弹性蛋白酶和样品的质量比为1:10～1:15。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为0.5～3h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的弹性蛋白酶酶切时间为1～1.5h。
6....
【专利技术属性】
技术研发人员：龚庆伟，冯艳，蒋燕，封启媛，徐军，谢灿，高相雷，李晓平，陈小锋，李文佳，
申请(专利权)人：广东东阳光药业有限公司，东莞东阳光药物研发有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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