可完全降解组织工程皮肤支架材料及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可完全降解组织工程皮肤支架材料，包括细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层和大孔径阵列微米纤维支架两部分，细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层为上层，大孔径阵列微米纤维支架上方为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层由木葡糖酸醋杆菌原位合成，表面固定有纤维素酶；所述大孔径阵列微米纤维支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维有序排列的支架，表面修饰有聚乳酸‑羟基乙酸生长因子缓释微球。本发明专利技术所用原料均无毒无害，纤维性质稳定，具有良好的生物相容性，能够在体内完全降解，下层支架的孔隙直径与细胞尺寸接近，使细胞能够进入，还能稳定释放生长因子，有利于皮肤组织再生。

Fully degradable tissue engineering skin scaffold material and its preparation method

【技术实现步骤摘要】
可完全降解组织工程皮肤支架材料及其制备方法
本专利技术涉及生物医用材料
，具体涉及一种可完全降解组织工程皮肤支架材料及其制备方法。
技术介绍
皮肤作为人体最大的器官，起着保护人体免受外界物体入侵的作用。皮肤的损伤可导致细菌、病原体的入侵，严重者可导致死亡。因此在过去的三十年中，生物医用材料和组织工程领域大量开展了皮肤支架的研究。人体皮肤为双层结构，由表皮和真皮组成。表皮主要由致密的角化细胞组成，起防护作用；真皮主要由成纤细胞及其分泌的胶原蛋白组成，有较好的弹性和机械强度，在皮肤再生过程中起重要的作用。双层支架材料应用于皮肤的修复，取得了良好的效果。但目前文献和公开专利中采用的双层支架多为微米多孔结构，且采用单一的方法制备。最新的组织工程支架研究表明，纳米纤维结构的支架能提供更多的细胞吸附位点，促进细胞的生长，因此，纳米纤维的双层支架对于皮肤的修复是一种更好的选择。然而采用静电纺丝制备的纳米纤维膜大多不能完全降解，还存在易收缩变形，纤维稳定性不足的现象，作为皮肤组织工程表皮支架时无法满足结构稳定性的要求；真皮支架结构则存在孔径较小，结构致密，不利于细胞进入支架内部形成三维培养的问题。3D打印制备支架时，虽然孔隙率和孔径大小可以调节，解决了静电纺丝纤维结构致密的问题，但是由于打印材料需要达到一定的硬度才能得到设计的形状和结构，这就造成3D打印支架应用于皮肤组织工程时硬度过大，难以彻底降解，不易与创面贴合，不利于细胞粘附和迁移。因此，寻找可完全降解、纤维稳定性强的纳米纤维膜和大孔径纤维支架材料构建功能稳定、利于细胞粘附生长的组织工程皮肤支架材料意义重大。
技术实现思路
本专利技术提供一种上层纤维网络稳定性强、下层孔径大、纤维规则排列的双层结构可完全降解组织工程皮肤支架材料及其制备方法。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种可完全降解组织工程皮肤支架材料，包括细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层和大孔径阵列微米纤维支架两部分，细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层为上层，大孔径阵列微米纤维支架上方为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层由木葡糖酸醋杆菌原位合成，表面固定有纤维素酶；所述大孔径阵列微米纤维支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维有序排列的支架，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。一种所述可完全降解组织工程皮肤支架材料的制备方法，包括以下步骤：步骤一、细菌纤维素/壳聚糖纤维层的制备：将溶解壳聚糖添加到木葡糖酸醋杆菌培养基中，原位合成细菌纤维素/壳聚糖复合凝胶，复合凝胶经0.5mol/LNaOH溶液常温碱解8-10h纯化后，再采用冻干法将纤维素酶固定在细菌纤维素/壳聚糖纤维的表面，得到细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层；步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维的制备：以丝素和透明质酸的混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用同轴静电纺丝技术得到以纺丝液1为壳层，纺丝液2为核层的聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维；步骤三、大孔径阵列微米纤维支架的制备：使用探针阵列收集器接收，得到大孔径阵列微米纤维支架材料，再将大孔径阵列微米纤维支架材料浸润在聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球溶液中，取出后真空干燥即得；步骤四、戊二醛交联：在培养皿中加入适量25wt％的戊二醛水溶液，然后将其放入干净密闭的干燥器底部，再将大孔径阵列微米纤维支架放在铝箔上，细菌纤维素/壳聚糖纤维层叠放在大孔径阵列微米纤维支架上方，将叠加后的支架材料置于干燥器孔板中间，盖好盖子并密封后，室温下交联8-12h，取出水洗，充分干燥。进一步地，步骤二所述聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维的制备方法，包括以下步骤：(1)丝素膜的制备：桑蚕丝脱胶后溶于80℃的氯化钙、水和乙醇体积比为1:8:2的混合溶液中，搅拌溶解，透析后得纯丝素溶液，流延成膜备用；(2)纺丝液1的制备：将丝素膜与相对分子质量为150万的透明质酸粉末共同加入甲酸溶液中，得到纺丝液1；(3)纺丝液2的制备：聚乳酸溶于氯仿和丙酮体积比2:1的混合溶剂中，配制成5wt％的聚乳酸溶液，室温搅拌均匀，得到纺丝液2；(4)同轴静电纺丝：取纺丝液1、纺丝液2分别装于10mL的注射器内，将注射器分别安装到两个SN-50微量注射泵上，再用聚四氟乙烯软管将纺丝液2连于内层针管，纺丝液1连于外层嵌套装置，对同轴装置施加相同高压，使纺丝液2核层液体与纺丝液1壳层液体在喷口处汇合而成同心分层流，在高压静电场的静电力牵引下，得到同轴复合纤维。进一步地，所述同轴静电纺丝的工艺参数为：电压12kV，收集距离15cm，核-壳溶液推进速度为0.1-0.2和0.3-0.4mL/h。进一步地，所述探针阵列收集器为将探针嵌入平板收集器泡沫板中，探针之间等距形成6×6阵列，探针间距为2-4cm。进一步地，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，将其加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。进一步地，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。大量细胞实验显示细菌纤维素没有细胞毒性，支持角化细胞和成纤维细胞的生长和增殖。本专利技术可完全降解组织工程皮肤支架材料所用细菌纤维素/壳聚糖纤维层为木葡糖酸醋杆菌原位合成细菌纤维素/壳聚糖纤维，与将细菌纤维素粉碎处理后再制成纤维相比，原位合成能够使复合纤维层保持细菌纤维素原来的网络结构，复合纤维也具有极高的稳定性。由于人体内没有纤维素酶，细菌纤维素无法在体内自行降解，因此通过冻干法将纤维素酶固定在细菌纤维素/壳聚糖纤维的表面实现其在体内的完全降解，并可通过纤维素酶的量来调节其降解周期。丝素与透明质酸的复合能够良好的模拟细胞外基质的蛋白与多糖结构，对细胞生长起到促进作用，但是二者复合后纤维的稳定性和力学强度较差，本专利技术通过以聚乳酸为核层，丝素与透明质酸复合为壳层，由于核壳溶液皆不易扩散，两者在喷口处汇合时间较短，故不会导致核壳溶液混合，因而能够采用同轴静电纺丝技术制备得到聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维膜，既能够有效调控丝素/透明质酸静电纺纤维的形态，降低纤维的溶失率，又能增强纳米纤维的稳定性和力学性能，显著提高了支架的弹性模量和压缩应力，同时不会影响纤维的生物相容性，壳层较高的孔壁粗糙度还有利于聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的结合。本专利技术在大孔径阵列微米纤维支架的制备过程中，使用传统平板接收器时，得到的纤维呈无序排列，而使用探针阵列收集器时，收集到的纤维呈规则有序排列。所得大孔径阵列微米纤维的孔隙率大于92％，比平板接收增加了11％；孔隙直径范围在50-120μm，平均孔径为68μm，是平板接收的四倍左右；在后续实验中大孔径阵列支架与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可完全降解组织工程皮肤支架材料，其特征在于，包括细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层和大孔径阵列微米纤维支架两部分，细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层为上层，大孔径阵列微米纤维支架上方为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层由木葡糖酸醋杆菌原位合成，表面固定有纤维素酶；所述大孔径阵列微米纤维支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维有序排列的支架，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。/n

【技术特征摘要】
1.一种可完全降解组织工程皮肤支架材料，其特征在于，包括细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层和大孔径阵列微米纤维支架两部分，细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层为上层，大孔径阵列微米纤维支架上方为下层，层间通过戊二醛交联结合；所述细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层由木葡糖酸醋杆菌原位合成，表面固定有纤维素酶；所述大孔径阵列微米纤维支架为静电纺乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维有序排列的支架，表面修饰有聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。


2.根据权利要求1所述可完全降解组织工程皮肤支架材料，其特征在于，所述聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法如下：配制生长因子水溶液，取PBS加入PLGA二氯甲烷溶液中，用超声细胞破碎仪超声分散10s至液体呈乳白色；然后将乳白色溶液到PVA溶液中，继续超声分散2min，至液体呈淡乳白色后，磁力搅拌2-4h，使二氯甲烷挥发完全；待微球成型后，离心、弃上清，用去离子水清洗沉淀，重复离心、清洗三次，-20℃冷冻，真空干燥后即得聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球。


3.根据权利要求2所述可完全降解组织工程皮肤支架材料，其特征在于，聚乳酸-羟基乙酸生长因子缓释微球的制备方法中离心转速为4000rpm，离心时间5min。


4.一种根据权利要求1所述可完全降解组织工程皮肤支架材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、细菌纤维素/壳聚糖纤维层的制备：将溶解壳聚糖添加到木葡糖酸醋杆菌培养基中，原位合成细菌纤维素/壳聚糖复合凝胶，复合凝胶经0.5mol/LNaOH溶液常温碱解8-10h纯化后，再采用冻干法将纤维素酶固定在细菌纤维素/壳聚糖纤维的表面，得到细菌纤维素/壳聚糖纳米纤维层；
步骤二、聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维的制备：以丝素和透明质酸的混合溶液为纺丝液1，聚乳酸溶液为纺丝液2，采用同轴静电纺丝技术得到以纺丝液1为壳层，纺丝液2为核层的聚乳酸/透明质酸/丝素微纳米纤维；
步骤三、大孔径阵列微米纤维支架的制备：使用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张正男，段书霞，韩涵，付迎坤，林建香，石沛龙，崔彬彬，王红磊，韩修恒，田崇，于肇锦，郝明，严子跃，佘开江，
申请(专利权)人：河南亚都实业有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41