一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途技术

本发明专利技术属生物组织工程和医用材料领域，涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法。本发明专利技术采用天然的小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。该再生生物支架其生物力学性能与正常小脑相似，能为神经通路的重建提供生理相似的通道从而正确引导其生长；所述支架表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子，有利于细胞的黏附生长并发挥生理功能；工程化的种子细胞既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。该再生生物支架可用于制备治疗神经损伤后神经修复制剂中。

Cerebellum acellular biological scaffold and preparation method and application thereof

The invention belongs to the field of biological tissue engineering and medical materials, and relates to a cerebellum extracellular matrix regeneration biological scaffold containing a plurality of neurotrophic factors after removing cells and a preparation method thereof. The present invention uses a natural cerebellar acellular scaffold as a scaffold material for cerebellar regeneration, and is three-dimensional network structure, and the spatial configuration conforms to the cerebellum physiological structure and spatial configuration. The regeneration scaffold biomechanical properties similar to normal cerebellum, similar to physiological channel can provide correct guidance for the reconstruction of the growth of neural pathways; the surface of the scaffold with cell membrane receptor recognition site, active factor, adhesion to the cell growth and play a physiological function; seed cells can secrete a variety of engineering nerve growth factor / nutrition, and can promote the formation of new extracellular matrix, provide guidance signal regeneration; has good biocompatibility. The regenerated biological stent can be used for preparing a nerve repairing preparation for treating nerve injury.

【技术实现步骤摘要】
一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途
本专利技术属生物组织工程和医用材料领域，涉及小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途，尤其涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法和在制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。
技术介绍
据报道，人体组织器官因为病变、损伤和衰老导致的器官功能失用导致临床上巨大的组织器官替代治疗缺口。临床实践中，由于可替代的器官来源有限，如何在体外采用人工的方法产生有功能的人体器官成为全世界关注的焦点。生物人工器官的研究已成为再生医学研究的热点，有着巨大的临床应用前景。据研究显示，生物人工器官的生成需要三个最基本的条件，其包括：具有特异性的功能细胞，理想的含有细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白的生物支架以及高度模拟体内状态的生物活性环境。所述ECM已被证明可以指导胚胎干细胞的分化，也是在器官发生中可以影响细胞行为的因素；有研究显示，通过生物工程的方法可以很好的对组织器官进行去细胞化，如果ECM蛋白结构能够很好的模拟目标组织ECM在体内的情况则能更好地使前体细胞向目标组织分化。最近有学者通过生物工程的方法将器官特异性的细胞选择性地灌注到靶器官的ECM支架中，成功在体外生成有功能的生物人工心脏、肺脏和肾脏，有关论文均发表在《naturemedicine》杂志上，这是国际上第一次通过生物工程的方法在不存在自体细胞的组织特异性全器官去细胞基质中生成有功能的生物人工器官。到目前为止，国内外尚未见有中枢神经系统(centralnervoussystem，CNS)组织器官体外再生的报道，也未见有理想的CNS生物支架的报道。业内已知，小脑是脑组织中相对独立和特殊的区域，在运动控制中发挥着重要的作用，在认知功能领域，如注意、语言、调节恐惧及愉悦的应答中发挥着一定的作用；小脑位于大脑半球后方，覆盖在脑桥及延髓之上，横跨在中脑和延髓之间，解剖位置相对独立，易于显微解剖分离，在小脑蚓部和半球表面存在有横行的沟和裂，将小脑分成许多回、叶和小叶，这是其特异性的形态表现；相较于大脑皮层的6层结构，小脑皮层分为三层，包括：分子层，浦肯野细胞层和颗粒细胞层，而且对比于大脑所有的多种神经元，小脑主要由两种神经元包括颗粒神经元、浦肯野神经元发挥作用，且最为重要的是，小脑半球的部分切除并不会造成机体严重的功能障碍；这些特殊性使得小脑成为研究CNS组织器官体外再生的突破点。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法，进一步用于神经损伤后神经修复治疗干预中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途，尤其涉及一种去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架及其制备方法和在制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。本专利技术提供了一种对神经干细胞(neuralstemcells,NSCs)的黏附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有显著作用和影响的新型小脑再生生物支架。本专利技术在现有技术的中枢神经系统器官脱细胞策略的基础上进行优化改进，制备出脱细胞彻底且ECM三维网状结构、功能更完整的小鼠小脑脱细胞支架；通对支架进行组织学观察、成分分析、免疫原性检测以及体内外相容性等研究评价其生物安全性，并进一步实验验证制得的脱细胞支架对人NSCs生物学特性的影响以及体内外生物相容性，为小脑再生的相关研究提供实验依据，为再生医学研究提供了一种方法和工具。更具体的，本专利技术的一种小脑脱细胞再生生物支架，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。本专利技术制得的小脑脱细胞再生生物支架，采用天然的小脑脱细胞支架作为小脑再生的支架材料，具有最接近小脑组织的三维结构，其生物力学性能与正常小脑相似，能为神经通路的重建提供生理相似的通道从而正确引导其生长；所述支架表面具备细胞膜受体识别位点、部分活性因子，有利于细胞的黏附生长并发挥生理功能；工程化的种子细胞(如重编程的类小脑颗粒样细胞等)既能分泌多种神经营养/生长因子，又能促进新的细胞外基质形成，提供再生引导信号；具有良好的生物相容性。本专利技术通过下述方法制备索所述的小脑脱细胞再生生物支架：其包括下述步骤：1，小脑再生支架的制备及鉴定，其中包括：1)小脑取材将获得的健康成年C57BL/6小鼠小脑组织，分离并去除所有的非中枢神经组织；2)小鼠小脑脱细胞，按下述顺序搅拌水浴过程脱细胞：1.0％SDS，去离子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去离子水，1.0％TritonX-100，1.0M蔗糖，去离子水；脱去细胞的小脑组织浸没在青霉素G，链霉素以及两性霉素B的PBS中保存72h，制得小脑脱细胞再生生物支架，4℃PBS中保存备用；3)支架的大体形态观察以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况；4)小脑支架的组织学观察与评价以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量；5)再生生物支架残留DNA定量和片段长度分析对残余DNA的含量和碱基对长度进行定量测定，其中，采用美国Invitrogen公司的Quant-iTPicoGreendsDNA检测试剂盒检测提取的DNA含量，按PicoGreendsDNA检测试剂盒说明书操作，1％琼脂糖凝胶电泳对残余DNA的碱基对长度进行测定；采用以下标准评价脱细胞的效果：(1)在DAPI和H&E切片上没有可见的细胞核；(2)DNA片段长度不超过200bp；(3)双链DNA的含量小于50ng/mg干燥ECM，为符合再生生物支架要求；6)BDNF和NGF含量测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量进行测定；2，体外生物相容性试验，包括：1)小脑再生支架ECM对NSCs的细胞毒性作用试验；2)小脑再生支架ECM对NSCs的增殖作用试验；3)小脑再生支架ECM对NSCs的迁移作用试验：4)小脑再生支架ECM对NSCs的分化作用试验；3，小脑脱细胞支架的扫描电镜观察，采用扫描电镜观察支架的结构；4，体内生物相容性试验，包括：1)动物分组：SD大鼠随机分为皮下组及颅内组，各组平均分为三个亚组：假手术组，明胶海绵组及小脑再生支架组；2)标本组织学观察移植后标本经多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE染色，光镜观察；免疫组化染色，检测CD4+和CD8+T淋巴细胞浸润数目用于评价支架的免疫原性；所获得的实验数据均经SPSS16.0统计分析软件处理；实验结果均以x±s表示。各组均数运用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行统计处理，p<0.05为差异有显著性，p<0.01为差异有非常显著性。结果显示：本专利技术的经过脱细胞处理的小脑经组织学证实细胞基本完全脱落，支架内未见细胞残留物，支架结构保存完好，电镜下三维网状结构完整存在，小鼠小脑脱细胞支架在HE染色及DAPI染色下未见细胞核残留，琼脂糖凝胶电泳结果显示，支架内未见长度超过200bp的DNA，DNA定量分析结果显示，支架内双链DNA的含量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。

【技术特征摘要】
1.一种小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。2.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的小脑组织选自健康成年C57BL/6小鼠。3.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的再生生物支架是去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架。4.制备权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架的方法：其特征在于，其包括下述步骤：1，小脑再生支架的制备及鉴定，其中包括：1)小脑取材将获得的健康成年C57BL/6小鼠小脑组织，分离并去除所有的非中枢神经组织；2)小鼠小脑脱细胞，按下述顺序搅拌水浴过程脱细胞：1.0％SDS，去离子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去离子水，1.0％TritonX-100，1.0M蔗糖，去离子水；脱去细胞的小脑组织浸没在青霉素G，链霉素以及两性霉素B的PBS中保存72h，制得小脑脱细胞再生生物支架，4℃PBS中保存备用；3)支架的大体形态观察以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况；4)小脑支架的组织学观察与评价以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量；5)再生生物支架残留DNA定量和片段长度分析对残余DNA的含量和碱基对长度进行定量测定，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱侗明，朱剑虹，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31