Kex2酶的变体及稳定表达的方法技术

本发明专利技术公开Kex2酶的变体及稳定表达的方法，所述变体是通过将Kex2氨基酸序列适当截短及点突变，将其变体通过组成型毕赤酵母表达系统可以稳定高效分泌表达目的蛋白，且保持良好的生物酶活性。此发酵工艺简单高效，成本低廉，产品活性高，可以适用于商业化生产。

Variation of Kex2 enzyme and method of stable expression

【技术实现步骤摘要】
Kex2酶的变体及稳定表达的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及Kex2酶的变体及稳定表达的方法。技术背景Kex2酶，为双碱内肽酶，基因来自酿酒酵母Saccharomycescerevisia，属于枯草杆菌蛋白酶家族，是一个钙离子依赖型的丝氨酸蛋白水解酶。Kex2能特异性识别蛋白质或多肽中的双碱性氨基酸残基对Lys-Arg或Arg-Arg，从第二个氨基酸残基羧基端(即Arg-)切断肽键，发挥作用。在酵母体内，kex2分子在核糖体上翻译，经过信号肽和前体肽的切除，以及复杂的O-连和N-连糖基化的过程，成为有活力的蛋白酶分子。作为真核生物的前体加工酶，Kex2可以在体内和体外环境下加工成熟很多哺乳动物的激素前体，不仅对于研究整个高等生物的前体加工酶家族非常重要，其在重组蛋白生产领域也非常重要。在前人研究中发现，kex2多数使用甲醇诱导型酵母表达系统，蛋白表达诱导工艺流程操作繁琐，且表达水平相对偏低，不利于产业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种Kex2酶的变体及稳定表达的方法，酶的变体具有良好酶活且可以适用于不含酵母粉或蛋白胨的低盐无机盐培养基，所述变体采用所述方法进行表达可以实现kex2酶的稳定高效分泌表达、高密度发酵制备以及纯化，可以获得高产量和纯度的终产品。本专利技术的第一方面，提供kex2酶稳定高效分泌表达的方法，所述方法包括：(1)提供kex2酶的变体，在变体C端加或者不加Histag标签；以SEQIDNO.1所示的全长Kex2的氨基酸序列位数计，所述变体为1-613位截短体、1-667位截短体、1-673位截短体、20-613位截短体、20-660位截短体、20-667位截短体或20-673位截短体；(2)将包含(1)的变体的DNA序列克隆到酵母表达载体上，获得重组表达质粒；(3)将包含(2)的重组表达质粒转化进入酵母内，获得重组酵母；(4)培养(3)的重组酵母，发酵并直接收取发酵上清；(5)步骤(4)中的发酵上清无需特殊前处理，直接稀释进行离子交换层析纯化获得kex2酶的变体。在本专利技术一种优选的实施方案中，本专利技术步骤(1)中所述变体：以SEQIDNO.1所示的全长Kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P。在一种具体实施例中，本专利技术步骤(1)中所述变体可以是：Kex2的第1-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第1-667位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第1-673位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-660位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-667位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-673位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签。本专利技术步骤(2)所述的重组表达质粒适用于毕赤酵母，其中含有kex2的变体的DNA序列。本专利技术步骤(2)所用酵母可以为本领域常用的酵母，优选为毕赤酵母。表达产物为组成型表达。本专利技术将所述的重组表达质粒转化酵母，培养转化有所述重组表达质粒的重组酵母，从而可以表达kex2酶。所述的重组表达质粒先经过线性化，然后转化毕赤酵母。转化毕赤酵母的转化方法可以为电转化或理化法制备毕赤酵母感受态细胞等。较佳的选择电转化。本专利技术所述方法表达的kex2酶的变体蛋白为可溶性分泌表达，因此可以直接收获发酵上清即可获取高表达目的蛋白。本专利技术步骤(4)发酵所用的培养基为不含酵母粉或蛋白胨的低盐无机盐培养基，所述培养基采用甘油或葡萄糖作为唯一碳源；专利技术人发现，本专利技术所述的变体可以适用于不含酵母粉或蛋白胨的低盐无机盐培养基，采用该培养基可以不影响目的蛋白的表达，同时还可以有效提高下游蛋白纯化的效率。在一种优选的实施例中，本专利技术步骤(4)中发酵采用的不含酵母粉或蛋白胨的低盐无机盐培养基组分为：七水硫酸镁4g-4.5/L、硫酸钾5-6g/L、二水硫酸钙0.3-0.5g/L、甘油30-40g/L、85％磷酸10-11g/L、85％氢氧化钾1-1.2g/L。专利技术人发现，采用该培养基可以提高蛋白表达，并进一步有效提高下游蛋白纯化的效率，且目的蛋白不易产生降解。本专利技术步骤(4)获得的发酵上清，无需进行分子筛脱盐或大体积稀释等前处理步骤，仅需要纯水稀释2-3倍，电导率控制在不超过2.5mS/cm即可直接进行阴离子交换层析，得到电泳纯度大于80％纯化的产物。本专利技术的第二方面，还提供Kex2酶的变体，所述变体可以是：Kex2的第1-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第1-667位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第1-673位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第20-660位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或Kex2的第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.稳定高效表达kex2酶的方法，其特征在于，所述方法包括：/n(1)提供kex2酶的变体，在变体C端加或者不加His tag标签；以SEQ ID NO.1所示的全长Kex2的氨基酸序列位数计，所述变体为1-613位截短体、1-667位截短体、1-673位截短体、20-613位截短体、20-660位截短体、20-667位截短体或20-673位截短体；/n(2)将包含(1)的变体的DNA序列克隆到酵母表达载体上，获得重组表达质粒；/n(3)将包含(2)的重组表达质粒转化进入酵母内，获得重组酵母；/n(4)培养(3)的重组酵母，发酵并直接收取发酵上清；/n(5)步骤(4)中的发酵上清无需特殊前处理，直接稀释进行离子交换层析纯化获得kex2酶的变体。/n

【技术特征摘要】
1.稳定高效表达kex2酶的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)提供kex2酶的变体，在变体C端加或者不加Histag标签；以SEQIDNO.1所示的全长Kex2的氨基酸序列位数计，所述变体为1-613位截短体、1-667位截短体、1-673位截短体、20-613位截短体、20-660位截短体、20-667位截短体或20-673位截短体；
(2)将包含(1)的变体的DNA序列克隆到酵母表达载体上，获得重组表达质粒；
(3)将包含(2)的重组表达质粒转化进入酵母内，获得重组酵母；
(4)培养(3)的重组酵母，发酵并直接收取发酵上清；
(5)步骤(4)中的发酵上清无需特殊前处理，直接稀释进行离子交换层析纯化获得kex2酶的变体。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中所述变体：以SEQIDNO.1所示的全长Kex2的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P；优选的，步骤(1)中变体选自：
Kex2的第1-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第1-667位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第1-673位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第20-613位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第20-660位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第20-667位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签；或
Kex2的第20-673位截短体，且以SEQIDNO.1所示的全长kex2酶的氨基酸序列位数计，其中第225位、436位、503位均由K突变为A或P，同时在截短体C端加或者不加Histag标签。


3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的酵母为毕赤酵母。


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【专利技术属性】
技术研发人员：辛中帅，陈慧梅，文良柱，王玉刚，朱亮，
申请(专利权)人：万新医药科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32