一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加培养方法技术

一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，培养方法主要包括破囊壶菌发酵培养基制备和流加葡萄糖的制备，菌种活化，种子液制备，发酵罐发酵培养，生物量干重、总油脂以及DHA产量的测定。本发明专利技术提供的发酵培养基及流加方法简单、方便操作，生产成本低，DHA产量高，有利于进一步放大生产，直至工业化生产，社会及经济效益巨大。

A single glucose carbon source fed batch fermentation medium and its fed batch culture method for high DHA production of Ampullaria

【技术实现步骤摘要】
一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加培养方法
本专利技术属于微生物发酵培养
，尤其涉及一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加培养方法。
技术介绍
二十二碳六烯酸（DHA）是重要的多不饱和脂肪酸，具有重要的生理功能，是人体心血管、神经和视觉系统发挥正常功能所不可缺少的物质。随着生活水平的提高，人们越来越重视DHA的补充。DHA正以各种各样的形式进入人们的生活。含DHA的食品正影响更广泛的人群，包括孕妇、哺乳期妇女、婴儿、儿童以及老人等。传统的DHA来源主要是深海鱼油，但是深海鱼油无论是从产量还是质量方面均难以满足现代社会人们的需求。近年来，学者们研究发现深海鱼类并不能从头合成长链多不饱和脂肪酸，而是通过海洋食物链，由海洋微生物最终积累在深海鱼体内的1。而这些能够产生多不饱和脂肪酸的微生物，包括：破囊壶菌、裂殖壶菌、隐甲藻等也越来越受到了研究者们的青睐。对海洋真菌类原生生物（破囊壶菌等）的研究，发现其细胞内所产生的油脂成分较为简单，油脂含量高，且其中DHA含量能占到总油脂的百分之三十以上。此外，油脂成分单一也有利于对其后续的分离纯化。此外，使用海洋真菌类原生生物进行多不饱和脂肪酸的生产还具有可以减少对海洋资源的消耗、避免有毒物质的污染、提高产品安全性等诸多优点2。因此海洋真菌类原生生物被认为是一种有潜力的新生资源。破囊壶菌（Thraustochytrids）是一类异养的类真菌海洋原生生物，能够生产大量的脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸。随着市场对DHA需求量的增加，人们开始致力于改善用破囊壶菌生产DHA的技术。其中获得高浓度的DHA是改善生物技术的最终目标，在培养过程中，营养物质是限制微生物生长及附加值产物积累的一个重要的限制因素，对培养基中营养物质的补充是一个很重要的发酵培养方法。因此，可考虑通过对培养基的碳源流加，补充培养基中的碳源，进而促进其菌体的生长及高附加值产物的积累，最终达到DHA高产的目的。【参考文献】1.程汝滨.裂壶藻遗传转化体系的建立和油脂合成相关基因的遗传转化[D].,2011.2.黄奠坤.多不饱和脂肪酸甘油酯的合成及超临界CO2萃取精制[D].武汉:武汉工程大学,2009。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加培养方法。一种高产DHA的破囊壶菌发酵培养基，成分及比例如下：发酵培养基成分为葡萄糖40-60g/L、酵母提取物5-15g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L。流加液成分：葡萄糖浓度600-800g/L。采用上述破囊壶菌发酵培养基及流加液的培养方法，该方法包括如下步骤：（1）破囊壶菌发酵培养基制备：配置3L发酵培养基，搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，装至5L发酵罐中，调节好发酵罐的pH电极及溶氧电极，进行密闭性及保压完成后，至灭菌锅，115℃灭菌21分钟，连接好冷却水管路，冷却至室温；（2）破囊壶菌流加液制备：配置流加液300-400mL，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，可50-60摄氏度水浴，加速溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至室温待用；（3）菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于通用培养基平板上三区划线，置28℃培养箱中培养24～48h，得活化菌种；（4）破囊壶菌种子液制备：种子液培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母提取物1g/L、蛋白胨1.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、人工海盐33g/L，自然pH。配制好种子液后，装至1L锥形瓶，每个瓶子装300ml培养基；挑取一环活化菌种接种于种子液培养基中，将其放入条件为150rpm，28±1°C的摇床中培养24-48h；（5）发酵罐发酵培养：在无菌火环的保护下，将摇制的300ml种子液接种进发酵罐中，调节溶氧、温度，使溶氧保持在30%，温度保持在28℃，转速与溶氧保持关联，持续发酵培养。通过对发酵培养基中碳源（葡萄糖）浓度测定，碳源消耗至一定量时，在36h-48h时，进行碳源的补加，即流加液流加50-100ml左右，此后，每隔一段时间进行流加一次，保持发酵培养基中碳源浓度稳定在一个范围内。根据培养周期进行流加，一般流加3-4次，培养4-5天。培养期间每24h进行取样检测；（6）测定生物量干重；（7）测定总油脂（TFA）、DHA产量。所述步骤（4）破壶囊菌种子液接种量为5%-10%。所述步骤（6）具体为：取出所述步骤（5）发酵液8-20ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量。所述步骤（7）具体为：A、取冻干的菌体加入2ml的4%的H2SO4-甲醇；B、100μl内标（1g/L十九烷酸），80°水浴1h后取出冷却；C、加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。本专利技术提供发酵培养基及培养条件简单，操作方便，生产成本低，DHA产量高，易于工业化生产，节能环保，经济和社会效益巨大：（1）使用单一的葡萄糖原料为碳源，操作方便，同时节省了生产成本；（2）使用发酵罐进行发酵培养，在放大的基础上，使用流加液进行流加，保证营养物质充足；（3）使用该流加发酵培养方法与分批发酵培养的方法相比，其菌体生物量有显著地增加，同时DHA及总油脂产量也有显著增，提高其原料利用效率。附图说明图1为破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的生物量（Biomass）随时间变化情况；图2为破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的总油脂（TFA）含量随时间变化情况；图3为破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的DHA含量随时间变化情况；图4为破囊壶菌Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的生物量（Biomass）随时间变化情况；图5为破囊壶菌Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的总油脂（TFA）含量随时间变化情况；图6为破囊壶菌Thraustochytriidaesp.PKU#Mn16使用分批发酵培养（Glu）与流加发酵培养（Glu+Glu）的DHA含量随时间变化情况；图7为一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养方法的流程图。破囊壶菌Schizochytriumsp.PKU#Mn4(拉丁文：Schizochytriumsp.PK本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：培养基成分及流加成分如下：/n发酵培养基成分为葡萄糖40-60g/L、酵母提取物5-15g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L；流加液成分：葡萄糖浓度600-800g/L。/n

【技术特征摘要】
1.一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：培养基成分及流加成分如下：
发酵培养基成分为葡萄糖40-60g/L、酵母提取物5-15g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L；流加液成分：葡萄糖浓度600-800g/L。


2.根据权利要求1所述一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：方法包括如下步骤：
（1）破囊壶菌发酵培养基制备：配置3L发酵培养基，搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，装至5L发酵罐中，调节好发酵罐的pH及溶氧电极，进行密闭性及保压完成后，至灭菌锅，115℃灭菌21分钟，连接好冷却水管路，冷却至室温；
（2）破囊壶菌流加液制备：配置流加液300-400mL，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，可50-60摄氏度水浴，加速溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至室温待用；
（3）菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于通用培养基平板上三区划线，置28℃培养箱中培养24～48h，得活化菌种；
（4）破囊壶菌种子液制备：
种子液培养基成分为：葡萄糖：20g/L、酵母提取物1g/L、蛋白胨1.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、人工海盐33g/L，自然pH；配制好种子液后，装至1L锥形瓶，每个瓶子装300ml培养基；挑取一环活化菌种接种于种子液培养基中，将其放入条件为150rpm，28±1°C的摇床中培养24-48h；
（5）发酵罐发酵培养：<...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪光义，姚力芬，叶会科，张赛，
申请(专利权)人：天津大学青岛海洋技术研究院，
类型：发明
国别省市：山东;37