一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法技术

本发明专利技术利用脂肪酶界面激活特性，发明专利技术了一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法，具体合成方法如下：首先构建反胶束酶体系，即在2‑乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）的异辛烷溶液中加入非固定化水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50 mmol/mL磷酸二氢钠‑磷酸氢二钠，pH 6.5~8），聚能超声获得澄清反胶束酶体系，其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再将0.5~0.8 g/（mL反应体系）植物油与甘油以摩尔比1:1~4混合加入反胶束酶体系中，在酶载量为总底物的1.5~3%、反应温度为40~60°C的条件下反应6~8 h，反应结束后加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200 rpm离心5 min，取上层油相，经HPLC测得甘油二酯含量为50.45%‑63.23%，最终通过二次分子蒸馏纯化产物，经HPLC法测得纯度80.82~95.87%。本发明专利技术具备高效率高产率生产甘油二酯的优点。

A method of synthesis of diacylglycerol in reverse micelles

【技术实现步骤摘要】
一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法
本专利技术属于粮油加工领域，具体涉及一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法。
技术介绍
结构脂质是一种天然油脂经过结构重组或改性而得到的具有特殊营养功效或生理功能的油脂，甘油二酯是其中一种，近年来，由于其具有良好的降脂减肥功能而受到广泛关注，研究发现，40名健康男性参与摄入甘油三酯油或甘油二酯油后，甘油三酯组餐后的乳糜微粒和血清中甘油三酯水平均显著高于甘油二酯组。甘油二酯的制备主要是在催化剂的作用下实现，根据催化剂不同大致可分为化学法和酶法，而根据反应机理的不同，也可分为直接酯化法、甘油解法、油脂部分水解法。化学法是指在无机催化剂作用下催化合成甘油二酯，是最传统也是应用最早的方法，具有成本低、工艺成熟的优点，但另一方面由于产物风味差、化学催化剂毒性大、反应温度高、选择性差等缺点使其在部分领域受到了限制。酶法是指在脂肪酶生物催化剂作用下合成甘油二酯，酶法具有反应条件温和、产物风味好、环境污染小等优点，因此在生产甘油二酯中的应用越来越广泛。直接酯化法具有反应易操作、产物的纯度高、反应时间短、易分离的优势，但反应以游离脂肪酸为原料，制备的成本较高，不能应用于工业生产。油脂水解是指通过控制一定条件，使TAG部分水解生成游离脂肪酸和甘油二酯，再分离得到甘油二酯，该法产物含量相对较低，水解条件比较难控制，所以也不太适合工业大规模生产。甘油解法是甘油与甘油三酯发生的醇解反应，是目前应用于工业化较多的一种方法，常见脂肪酶，如Rhizomucormiehei脂肪酶、Thermomyceslanuginosa脂肪酶、CandidaAntarcticaB脂肪酶等，均被证明具有优秀的催化甘油解合成甘油二酯的能力，比如同时，酶反应媒介广泛，在水溶液、有机溶剂、超临界CO2流体等中均可进行有效的酯化反应。然而随着研究的深入，酶法催化甘油解合成甘油二酯也暴露出较多问题，其中最主要的问题就是脂肪酶催化活性低，导致反应速度较慢，反应时间长。脂肪酶的活性位点上有一个“盖子”结构，这是其活性低的主要原因，而在油水界面上，盖子结构发生位移，暴露出活性位点，酶活性增大，此即为脂肪酶的界面活化效应。脂肪酶的固定化即利用了脂肪酶的界面活化效应，并通过载体将活化态酶加以固定，从而提高催化活性。但另一方面，若能提供一个稳定的油水界面作为酯化反应场所，同样可能提高酯化效率。反胶束是一种自发形成的纳米尺度的聚集体，是一种透明的、热力学稳定的W/O体系，由浓度超过临界胶束浓度的表面活性剂形成，其中表面活性剂极性基团朝内排列形成一个极性核，当该极性核溶解酶液后，该体系构成反胶束酶体系。反胶束酶体系具有较大的油水界面，且由于表面活性剂的辅助作用，界面稳定性良好，脂肪酶在该体系中被界面激活，加之酶溶解在极性核后呈分子水平扩散，降低扩散阻力，增大了与底物的接触机会，以上优势均可提高产物得率，因此该体系在酯化合成方面具有很好的应用前景。已有的反胶束酶体系的制备方法较为简单，将表面活性剂溶液和酶液混合并充分震荡至澄清即可，但该法制备的反胶束体系存在液滴大小不均匀，稳定性较差等问题。一方面，稳定性差使得体系不可长时间利用；另一方面，反胶束中的液滴大小和脂肪酶的尺寸之间的关系是决定脂肪酶在反胶束体系中活性的重要因素之一，故由于液滴大小不均匀性，酶活性提高不完全且结果重复性差。超声波是一种频率高于20kHz的声波，其机械效应可促成液体的乳化、凝胶的液化和固体的分散，研究表明超声波辅助制备的乳液具有较高的稳定性且液滴均匀，考虑到反胶束体系是一种类似于乳液的体系，故超声波可能对反胶束酶体系具有相似的影响。除此之外，超声波的空化作用还可起到搅拌作用，使底物和酶充分接触，最终提高得率。因此，本法将反胶束体系应用到脂肪酶催化甘油二酯化反应中，并在反胶束体系制备和反应物合成过程中均辅以超声作用，在较短时间内合成高产率产品，具有高效率高产率生产植物甾醇酯的优点。
技术实现思路
本专利技术公开了一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法，以克服现有技术在合成甘油二酯的不足，所述反胶束酶体系由脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合而成，其中表面活性剂溶液由2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）和异辛烷组成，脂肪酶为非固定化水溶性脂肪酶，缓冲水溶液为50mM磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（PBS），目标重产物为甘油二酯。本专利技术包括以下几个步骤：（1）均一化反胶束酶体系的构建在AOT异辛烷溶液中加入非固定化水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50mol/mLPBS，pH6.5~8），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30,再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20~30kHz，功率为200~400W，超声温度为40~60°C，超声总时间为35~56s，超声方式为“超声5s-停2s”。（2）在反胶束酶体系中合成植物甾醇酯将0.5~0.8g/（mL反应体系）植物油与甘油以摩尔比1:1~4混合加入反胶束酶体系中，在酶载量为总底物的1.5~3%、反应温度为40~60°C的条件下反应6~8h，过程中辅以发散超声作用，超声功率为30~40kHz，功率为200~400W，超声方式为“超声10s-停20s”，反应结束后加入2倍反应液体积的水，震荡分层，4200rpm离心5min，取上层油相，经HPLC测得甘油二酯含量为50.45~63.23%。（3）利用分子蒸馏纯化产物首先在进料速率1~2mL/min、加热温度180~200℃、冷凝温度20℃、刮板速度200-250r/min、真空度0.1~0.2pa的条件下进行一级分子蒸馏，除去游离脂肪酸等一级轻相，再对一级重相进行二级分子蒸馏，在进料速率1~2mL/min、加热温度220~240℃、冷凝温度20℃、刮板速度200-250r/min、真空度0.1~0.2pa的条件下进行，经HPLC检测二级轻相中甘油二酯的含量为80.82~95.87%。本专利技术的有益效果是：（1）采用聚能超声辅助制备含有脂肪酶的水/AOT/异辛烷反胶束酶体系，再采用发散超声辅助促进酶法催化合成合成甘油二酯，具有生成条件温和，酯化率高，产量高的优点。（2）采用分子蒸馏法纯化产物，操作简单，纯度高，可大批量制备后进一步用于动物实验，研究其降脂减肥动能，进而研究其对人体心血管疾病的影响。（3）本方法描述的甘油二酯合成方法简单，易于操作，可以适用于各类结构脂质的合成。具体实施方式实施例1将一定质量的AOT溶于异辛烷中，经过漩涡振荡器充分混合至澄清，得AOT异辛烷溶液，再加入一定量CandidaAntarcticaB脂肪酶缓冲水溶液（50mol/mLPBS，pH7.5），得反胶束酶溶液，其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3:375:25,再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为25kHz，功率为300W，超声温度为50°C，超声总时间为42s，超声方式为“超声5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法，其特征是：/n（1）将脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合，通过聚能超声，构成均一的反胶束酶体系；/n（2）往体系中加入反应底物植物油和甘油，辅以发散超声作用，反应得到甘油二酯；/n（3）利用分子蒸馏技术纯化产物。/n

【技术特征摘要】
1.一种在反胶束酶体系中合成甘油二酯的方法，其特征是：
（1）将脂肪酶缓冲水溶液和表面活性剂溶液混合，通过聚能超声，构成均一的反胶束酶体系；
（2）往体系中加入反应底物植物油和甘油，辅以发散超声作用，反应得到甘油二酯；
（3）利用分子蒸馏技术纯化产物。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述所述构成反胶束酶体系的表面活性剂溶液由2-乙基己基琥珀酸酯磺酸钠（AOT）和异辛烷组成，所述脂肪酶为非固定化水溶性脂肪酶，所述缓冲水溶液为50mmol/mL磷酸二氢钠-磷酸氢二钠（PBS），目标终产物为甘油二酯。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述反胶束酶体系构建方法是在AOT异辛烷溶液中加入非固定化水溶性脂肪酶缓冲水溶液（50mmol/mLPBS，pH6.5~8），其中[酶]（mg/mL）:[水]（mmol/mL）:[AOT]（mmol/mL）=3~8:200~600:20~30，再采用聚能超声进行均一化，聚能超声频率为20~30kHz，功率为200~400W，超声温度为40~60°C，超声总时间为35~56s，超声方式为“超声5s-停2s”。


4.如权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓泽元，张兵，陈孙妮，李静，李红艳，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36