溴敌隆纳米抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种溴敌隆纳米抗体及其应用。本发明专利技术利用溴敌隆半抗原及其人工抗原免疫动物后能够产生高效价、高亲和力和特异性强的淋巴细胞，分离B淋巴细胞后，提取其RNA，构建纳米抗体文库，筛选高灵敏度的纳米抗体。可特异性结合溴敌隆的纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。该抗体的IC

Bromadiolone nanoantibody and its application

【技术实现步骤摘要】
溴敌隆纳米抗体及其应用
本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种溴敌隆纳米抗体及其应用。
技术介绍
溴敌隆(bromadiolone，BRD)是一种适口性好、毒性大、靶谱广的高效杀鼠剂。它不但具备敌鼠钠盐、杀鼠醚等第一代抗凝血剂作用缓慢、不易引起鼠类惊觉、容易全歼害鼠的特点，而且还具有急性毒性强的突出优点，单剂量使用对各种鼠都能有效地防除。动物取食中毒死亡的老鼠后，会引起二次中毒。对鱼类、水生昆虫等水生生物有中等毒性。近年来，随着此类灭鼠剂取代毒鼠强、氟乙酰胺等急性灭鼠药的广泛应用，常会发生误食事件。而溴敌隆中毒的快速诊断是减少人员伤亡的关键，因此，开发稳定、快速、高灵敏、高通量的溴敌隆检测方法，对于保障我国食品安全、减少由此带来的人员伤亡具有重要意义。免疫分析法由于简单快速、价格低廉、无需专业技术人员、适用于现场大量样品的快速筛选等优点，在有害化合物快速检测领域广泛应用。免疫分析法中，作为核心试剂的抗体，决定着分析方法的灵敏度、特异性和稳定性。常规的IgG抗体由两条重链和两条轻链组成，具有结构复杂、稳定性差、生产成本高、不易进行体外改造等缺点，极大地限制了其在实际样本检测中的应用。在骆驼科动物体内存在天然缺失轻链的重链抗体(heavychainantibody，HCAb)。通过基因工程技术可以获得保留抗原结合活性的HCAb的重链可变区(variabledomainoftheheavychainofHCAbs，VHH)，称为单域抗体(singledomainantibody，sdAb)。由于sdAb的尺寸处于纳米级别，故又称之为纳米抗体(nanobody，Nb)。纳米抗体耐受性强、结构简单、易于体外进化、生产成本低等特性弥补了传统抗体的不足，对于溴敌隆的免疫学检测方法有重要的实用价值。因此亟需开发新的用于检测溴敌隆的纳米抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种溴敌隆纳米抗体及其应用。为了实现本专利技术目的，专利技术人利用噬菌体展示技术，从溴敌隆免疫羊驼的外周血中分离淋巴细胞，提取RNA，构建溴敌隆纳米抗体库，并从抗体库中筛选获得了一种分子量小、稳定性强、易克隆表达、可特异性结合溴敌隆的纳米抗体。第一方面，本专利技术提供一种溴敌隆纳米抗体，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；或ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。所述溴敌隆纳米抗体的结构分析如图3所示，其氨基酸序列的结构域包括四个框架区(Frameworkregion，FR)和三个互补决定区(Complementarity-determiningregion,CDR)。第二方面，本专利技术提供编码所述溴敌隆纳米抗体的核酸分子。优选地，所述核酸分子的序列如SEQIDNO:2所示。本专利技术提供的核酸分子或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括但不限于细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫细胞，植物细胞或无细胞表达系统。进一步地，本专利技术提供一种载体，包含所述核酸分子。由于遗传密码子具有简并性，该核酸分子可以根据不同的应用目的而不同。进一步地，本专利技术提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含所述蛋白质或表达载体。第三方面，本专利技术提供含有上述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。第四方面，本专利技术提供一种溴敌隆检测试剂或试剂盒，有效成分为SEQIDNO:1所示的溴敌隆纳米抗体。第五方面，本专利技术提供一种适用于溴敌隆残留分析的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括盒体、设在盒体内可拆卸的酶标板以及设在盒体内的试剂；所述酶标板的每个孔包被有溴敌隆人工抗原，所述试剂包括SEQIDNO:1所示的抗体，以及溴敌隆标准溶液、酶标二抗、缓冲液PBS、洗涤液PBST、显色液和反应终止液等中的至少一种。第六方面，本专利技术提供所述溴敌隆纳米抗体的以下任一应用：1)用于溴敌隆检测；2)用于制备溴敌隆检测试剂或试剂盒；3)用于溴敌隆的富集和纯化；4)用于制备溴敌隆的富集和纯化试剂。本专利技术还提供基于所述溴敌隆纳米抗体与溴敌隆特异性结合的能力，建立的一种溴敌隆的检测方法。优选地，所述方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)，化学发光免疫分析法(Chemiluminescenceimmunoassay，CLIA)，荧光免疫法(Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片法，亲和层析法和免疫层析法等。进一步地，可以将SEQIDNO:1所示的溴敌隆纳米抗体作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，这些突变体均属于本专利技术保护范围。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：利用本专利技术提供的溴敌隆纳米抗体能够准确灵敏地检测样品中的溴敌隆残留，该抗体的IC50值为1.9ng/mL，线性检测范围为0.54-7.21ng/mL。该抗体具有结构简单、耐高温、耐酸碱以及易于生产等特性，对于溴敌隆的低成本、大批量样品的溴敌隆残留现场检测具有重要意义。附图说明图1为本专利技术实施例1中溴敌隆半抗原结构图。图2为本专利技术实施例2中每轮筛选后多克隆phage-ELISA灵敏度变化。图3为本专利技术溴敌隆纳米抗体的结构分析情况。图4为本专利技术实施例4中利用间接竞争ELISA法进行溴敌隆的检测所建标准曲线。图5为本专利技术实施例5中溴敌隆纳米抗体的酸碱(A)及热稳定性(B)试验结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1抗溴敌隆纳米抗体免疫文库的构建将改造后的溴敌隆半抗原(图1)与牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA)共价偶联，得到溴敌隆人工抗原BRD-BSA，取300μgBRD-BSA与弗氏完全佐剂混合乳化后，对羊驼(Alpaca)进行皮下多点注射免疫。加强免疫采用150μgBRD-BSA与弗氏不完全佐剂混合乳化，间隔三周进行，每次免疫七天后静脉取血，采用间接ELISA法测定血清效价，采用间接竞争ELISA法测定抗血清特异性及灵敏度，选择血清效价较高且特异性及灵敏度最好的样品分离淋巴细胞，提取RNA。采用密度梯度离心法分离外周血淋巴细胞，之后用Trizol法提取淋巴细胞RNA。以RNA为模本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.溴敌隆纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：/ni)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或/nii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或/niii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。/n

【技术特征摘要】
1.溴敌隆纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含如下的氨基酸序列或由其组成：
i)SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；或
ii)在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或
iii)i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。


2.编码权利要求1所述抗体的核酸分子。


3.含有权利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。


4.溴敌隆检测试剂或试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈建忠，王战辉，于雪芝，温凯，江海洋，杨慧娟，张素霞，史为民，郭柳川，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11