一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术实施例公开了一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到；本发明专利技术上述单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，能够用于氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种的同时检测，且上述单克隆抗体特异性强，检测灵敏度较高。

A monoclonal antibody for the recognition of florfenicol, chloramphenicol and methamphenicol and its application

【技术实现步骤摘要】
一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用
本专利技术实施例涉及检测
，具体涉及一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
氟苯尼考是酰胺醇类第3代动物专用抗菌药，具有广谱、高效、吸收好、体内分布广、无致再生障碍性贫血作用等特点，作为氯霉素的替代药物被广泛用于治疗畜禽的细菌性疾病。研究表明，氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素具有胚胎毒性和耐药性，在畜禽生产上的大量应用也导致其在畜禽产品中残留，危害公众健康。欧盟、日本等国均制定了动物食品中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素的最大残留量标准，中国农业部235号公告也对其残留限量做出了严格规定，家禽肌肉中氟苯尼考(FF)最高残留限量为100μg/kg，氯霉素Chloramphenico(CAP)及其盐、酯在所有食品动物可食用组织中不得检出，甲砜霉素Thiamphenicol(TAP)在家禽肌肉中最高残留限量为50μg/kg。目前，抗生素的检测方法有多种，仪器方法主要有薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、高压液相色谱法(HPLC)和各种联用技术如气质联用(GC-MS)、液质联用(HPLC-MS)等；快速方法主要是基于免疫化学基础上的免疫分析方法如免疫亲合柱-荧光检测(IAC-FLD)、酶联免疫吸附法(ELlSA)和胶体金免疫层析方法等。确认方法测定的结果准确，但是仪器设备价格昂贵，前处理过程复杂、操作繁琐、效率低，成本极高，因此不适用于大规模样本的筛查和日常的内控检测。快速方法酶联免疫吸附法ELISA法和胶体金快速检测卡是企业常用的快速检测方法，但也均存在各自的优缺点：ELISA方法能灵敏度相对较高，且能定量检测，但操作的过程相对复杂，步骤较多，检测时间较长，对环境和人员要求高，环境和基质干扰严重，且需要使用标准品，对操作人员危害比较大；胶体金检测卡可以满足现场快速的要求，能在5-10min内快速测定，但是只能定性，定量的范围很窄，且灵敏度较低，家禽肉眼观察主观性较强，重复性差。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，该单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，因此能够将上述单克隆抗体用于氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种的检测中，而且检测灵敏度较高。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面提供一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，所述单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2019152的氟苯尼考FF3C11细胞株分泌得到。本专利技术上述单克隆抗体能够同时与氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素特异性结合，能够检测氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素中任意一种或多种。根据本专利技术实施例的第二方面提供一种上述单克隆抗体在氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素检测中的应用。根据本专利技术实施例的第三方面提供一种检测肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测卡，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述结合垫中含有量子点标记的单克隆抗体，所述量子点标记的单克隆抗体中的单克隆抗体由保藏编号为CCTCCNO:C2019152的氟苯尼考FF3C11细胞株分泌得到，所述基膜上分别设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述检测线上包被有氯霉素全抗原。本专利技术上述检测卡通过选择特定单克隆抗体以及采用量子点进行标记，能够快速、准确、定量地检测肉类中的氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的残留。进一步地，所述量子点为ZnS核/CdSe复合量子点。本专利技术选择ZnS核/CdSe复合量子点，荧光强度高，量子点效率级数为0.5，稳定性好，且可以耐受多次激发；量子点的吸收光谱宽且连续，可实现一元激发，多元发射，适合于多色标记能够发射红光，且耐受时间长的效果，能够更好的提高检测卡的检测效果。进一步地，所述量子点标记的单克隆抗体通过如下方法制得：(a)将量子点进行清洗、活化；(b)将活化的量子点微球与单克隆抗体混匀、孵育；(c)将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的单克隆抗体。进一步地，所述活化具体包括如下步骤：将N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)分别溶解于pH6.050mMMES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的溶液；随后，在清洗后的量子点中添加NHS溶液并混匀，再添加DCC溶液并混匀，然后室温孵育20-30min、离心去掉上清液、重悬即可。进一步地，所述NHS和DCC的溶液的浓度均为20mg/ml；所述NHS溶液、DCC溶液和量子点的体积比是1∶1∶2。进一步地，所述结合垫通过如下方法制得：将含有0.5％TritonX-100、0.5％丙氨酸、0.05％NaN3的pH9.00.01MPBS缓冲液喷涂到结合垫上，烘干；随后，将量子点标记的单克隆抗体喷涂到烘干后的结合垫上，干燥即可。进一步地，所述样品垫通过如下方法制得：将含有0.5％TritonX-100、0.5％BSA的pH9.00.01MPBS缓冲液喷涂到样品垫上，烘干即可。进一步地，所述全抗原通过如下方法制得：将氯霉素与琥珀酸酐溶于无水吡啶中在60℃回流24h，随后氮吹去除吡啶，再采用乙酸乙酯进行复溶，静置分层，进行洗涤得到衍生溶液；再将衍生溶液进行减压浓缩、避光真空干燥得到半抗原；采用N，N-二甲基甲酰胺溶解半抗原，再加入N-羟基琥珀酰亚胺和N-N-二环己基碳酰亚胺，室温避光搅拌反应，即得活化中间产物；随后将活化中间产物在搅拌下逐滴加到含10mg载体蛋白的1mlPBS缓冲液中进行搅拌反应、透析，即得全抗原。进一步地，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或齿孔血蓝蛋白。根据本专利技术实施例的第四方面提供一种肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测方法，所述检测方法采用上述检测卡进行检测；所述检测方法包括将样品置入乙酸乙酯水溶液中进行提取，取上清液进行氮气吹干，再采用样品稀释液进行复溶得到混合溶液，再将混合溶液用于检测；所述样品稀释液包括如下重量份组分：磷酸二氢钾0.6g、氯化钾0.3g、十二水磷酸氢二钠7.5g、氯化钠4.5g和蒸馏水0.5L。本专利技术实施例具有如下优点：(1)本专利技术采用免疫学、化学、生物技术、计算机软件、食品科学等几大学科交叉合作，本专利技术制备的基于量子点标记的同时定量检测肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留的检测卡，可同时快速、准确、定量地检测家禽肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，解决了现有技术中利用一种抗体和抗原即可同时定量检测三种抗生素的瓶颈。(2)本专利技术检测卡采用量子点标记单克隆抗体，包被原采用琥珀酸酐法偶联载体蛋白的氯霉素全抗原，满足氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素三种物质的同时定量检测。(3)本专利技术检测卡可以快速、灵敏、准确的同时定量检测家禽肉类中氟苯尼考、氯霉素、甲砜霉素残留，大大缩短了检测时间，减少了操作步骤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCC NO:C2019152的氟苯尼考FF 3C11细胞株分泌得到。/n

【技术特征摘要】
1.一种识别氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCCNO:C2019152的氟苯尼考FF3C11细胞株分泌得到。


2.权利要求1所述的单克隆抗体在氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素检测中的应用。


3.一种检测肉类中氟苯尼考、氯霉素和甲砜霉素残留的检测卡，其特征在于，所述检测卡包括底板、样品垫、结合垫、基膜和吸水垫，所述结合垫中含有量子点标记的单克隆抗体，所述量子点标记的单克隆抗体中的单克隆抗体为权利要求1所述的单克隆抗体，所述基膜上分别设置有检测线和控制线，所述控制线上包被有羊抗鼠IgG的抗体，所述检测线上包被有氯霉素全抗原。


4.根据权利要求3所述的检测卡，其特征在于，所述量子点为ZnS核/CdSe复合量子点。


5.根据权利要求3或4所述的检测卡，其特征在于，所述量子点标记的单克隆抗体通过如下方法制得：
(a)将量子点进行清洗、活化；
(b)将活化的量子点微球与单克隆抗体混匀、孵育；
(c)将向孵育后的混合物中添加封闭液、再次孵育、离心、收集沉淀并重悬，即得所述量子点标记的单克隆抗体。


6.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述活化具体包括如下步骤：
将NHS和DCC分别溶解于pH6.050mMMES的缓冲液中，分别得到NHS溶液和DCC的...

【专利技术属性】
技术研发人员：武玉香，沈志强，张莎莎，
申请(专利权)人：山东绿都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37