抗金刚烷胺AMD单链抗体scFv及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种抗金刚烷胺AMD单链抗体及其制备与应用。本发明专利技术能够从分泌金刚烷胺AMD的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3F2中，通过基因工程手段获得该抗体重链和轻链可变区基因，通过将两个基因重组后，构建原核表达质粒载体，转化大肠杆菌表达出能够特异性识别AMD的scFv抗体活性片段。通过实验证明：本发明专利技术制备的重组单链抗体scFv具有与金刚烷胺AMD特异性识别和结合的活性。利用本发明专利技术的重组单链抗体对金刚烷胺的识别与结合活性可实现金刚烷胺的残留检测，且所构建的转化载体质粒易于保存与大量生产。

ScFv and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
抗金刚烷胺AMD单链抗体scFv及其制备方法与应用
本专利技术涉及一种金刚烷胺AMD单链抗体scFv及其制备方法，具体涉及所述单链抗体的蛋白序列及其编码基因序列，含有所述编码基因的载体及制备所述单链抗体的方法，属于生物制品领域。
技术介绍
在畜牧养殖中金刚烷胺等抗病毒药物用于A型流感病毒预防和治疗，但是金刚烷胺的滥用容易引起耐药性、促进毒株变异而危害人类健康，并且具有神经毒性等一系列的副作用，如引起人神经过敏、焦虑、噩梦等症状。我国农业部2005年第560号公告明确规定金刚烷胺和金刚乙胺等抗病毒药物在兽医上禁止使用，美国FDA于2006年也禁止将金刚烷胺和金刚乙胺等人类抗病毒药物用于畜禽类。因此，急需建立鸡肉中该类残留药物的快速检测方法，以加强对该类药物的残留监管，有效保护人类健康。目前已报道的金刚烷胺残留检测方法多采用仪器方法，虽然具有灵敏度高、结果准确等优点，但是不能达到快速、操作简便的要求。以单克隆抗体为基础的免疫检测方法具有快速、成本低、易操作的特点，但是随着蛋白质工程技术的发展单链抗体作为单克隆抗体的替代者，具有易大规模生产，成本低、可修饰等优点。scFv是用基因工程方法将抗体重链和轻链可变区通过一段连接肽连接而成的重组蛋白，是保持了亲本抗体的抗原性和特异性的最小功能型抗体片段。scFv分子由于只保留了抗体的VH和VL部分，去除了不与抗原结合的部分，大小相当于完整IgG的1/6，可与底物显色酶、荧光分子、标签分子等融合或标记。作为单克隆抗体的替代物，由于其对抗原的单价结合特性，操作性强(突变进化等)，scFv在免疫检测领域，特别是小分子检测方面，展示出了更为灵敏的检测性能。目前关于金刚烷胺AMD单链抗体scFv的研究国内外未见报道，相关专利的申请国内外亦未见报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种抗金刚烷胺的单链抗体。本专利技术提供的抗金刚烷胺的单链抗体是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；所述重链可变区的氨基酸序列为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：(a1)包括SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；(a2)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；(a3)将SEQIDNo.3所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；(a4)与SEQIDNo.3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；所述轻链可变区的氨基酸序列为(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：(b1)包括SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；(b2)SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；(b3)将SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；(b4)与SEQIDNo.5所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。上述单链抗体中，所述连接肽为SEQIDNo.1自N末端起第113至132位所示的氨基酸残基。上述单链抗体中，所述单链抗体的氨基酸序列为(c1)或(c2)或(c3)：(c1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；(c2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；(c3)与SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。本专利技术的另一个目的是提供上述单链抗体的衍生物。所述衍生物为如下(f1)-(f6)中任一种：(f1)含有上述单链抗体的融合蛋白；(f2)含有上述单链抗体的多特异或多功能分子；(f3)含有上述单链抗体的组合物；(f4)含有上述单链抗体的免疫偶联物；(f5)将上述单链抗体或其抗原结合部分进行修饰和/或改造后得到的抗体；(f6)含有上述重链可变区和/或上述轻链可变区的抗体。本专利技术又有一个目的是提供与上述单链抗体相关的生物材料。所述生物材料为(g1)或(g2)：(g1)编码上述单链抗体的核酸分子；(g2)含有(g1)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。上述生物材料中，所述核酸分子为如下(h1)-(h3)中任一种：(h1)SEQIDNo.2或SEQIDNo.4或SEQIDNo.6所示的DNA分子；(h2)与(h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述单链抗体或上述重链可变区或上述轻链可变区的DNA分子；(h3)在严格条件下与(h1)或(h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述单链抗体或上述重链可变区或上述轻链可变区的DNA分子。其中，SEQIDNo.2所示的DNA分子为上述单链抗体的编码基因序列；SEQIDNo.4所示的DNA分子为上述单链抗体重链可变区的编码基因序列；SEQIDNo.6所示的DNA分子为上述单链抗体轻链可变区的编码基因序列。上述生物材料中，所述重组载体为将SEQIDNo.2所示的DNA分子插入载体pJB33的SfiI酶切位点间得到的载体。该重组载体表达SEQIDNo.1所示的单链抗体scFv。所述重组菌为将所述重组载体导入RV308宿主细胞得到的菌。本专利技术还有一个目的是提供上述单链抗体或衍生物或生物材料的新用途。本专利技术提供了上述单链抗体或衍生物或生物材料在如下(1)-(8)中任一种中的应用：(1)特异性识别和/或结合金刚烷胺；(2)制备特异性识别和/或结合金刚烷胺的产品；(3)金刚烷胺残留检测；(4)制备金刚烷胺残留检测的产品；(5)检测待测样品中是否含有金刚烷胺；(6)制备检测待测样品中是否含有金刚烷胺的产品；(7)检测待测样品中金刚烷胺含量；(8)制备检测待测样品中金刚烷胺含量的产品。上述生物材料在制备上述单链抗体中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术最后提供了制备上述单链抗体的方法。本专利技术提供的制备上述单链抗体的方法是发酵培养上述重组菌，得到所述单链抗体。所述方法包括如下步骤：(1)将上述单链抗体的编码基因导入宿主菌中，得到重组菌；(2)诱导表达所述重组菌，得到所述单链抗体。上述方法中，所述单链抗体的编码基因通过重组载体导入宿主菌；所述重组载体是将所述单链抗体的编码基因插入表达载体的酶切位点间得到的。上述方法中，所述诱导表达的方法具体如下：将重组菌接种于2×YT-G培养基中，振荡培养至OD600nm＝1.0时加入IPTG诱导表达，在诱导培养16h时收集菌液，离心，收集菌体沉淀。用渗透休克提取液重悬所述菌体沉淀，离心，收集上清液A和菌体沉淀A，并向菌体沉淀A中加入无菌水重悬沉淀，离心，收集上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗金刚烷胺的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；/n所述重链可变区的氨基酸序列为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：/n(a1)包括SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；/n(a2)SEQ ID No.3所示的氨基酸序列；/n(a3)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；/n(a4)与SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；/n所述轻链可变区的氨基酸序列为(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：/n(b1)包括SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；/n(b2)SEQ ID No.5所示的氨基酸序列；/n(b3)将SEQ ID No.5所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；/n(b4)与SEQ ID No.5所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种抗金刚烷胺的单链抗体，是由重链可变区、连接肽和轻链可变区组成的多肽；所述连接肽位于所述重链可变区与所述轻链可变区之间；
所述重链可变区的氨基酸序列为(a1)或(a2)或(a3)或(a4)：
(a1)包括SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；
(a2)SEQIDNo.3所示的氨基酸序列；
(a3)将SEQIDNo.3所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(a4)与SEQIDNo.3所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链可变区的氨基酸序列为(b1)或(b2)或(b3)或(b4)：
(b1)包括SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；
(b2)SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；
(b3)将SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(b4)与SEQIDNo.5所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的单链抗体，其特征在于：所述连接肽为SEQIDNo.1自N末端起第113至132位所示的氨基酸残基。


3.根据权利要求1或2所述的单链抗体，其特征在于：所述单链抗体的氨基酸序列为(c1)或(c2)或(c3)：
(c1)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；
(c2)将SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经过一个或两个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(c3)与SEQIDNo.1所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。


4.权利要求1-3任一所述的单链抗体的衍生物，为如下(f1)-(f6)中任一种：
(f1)含有权利要求1-3任一所述的单链抗体的融合蛋白；
(f2)含有权利要求1-3任一所述的单链抗体的多特异或多功能分子；
(f3)含有权利要求1-3任一所述的单链抗体的组合物；
(f4)含有权利要求1-3任一所述的单链抗体的免疫偶联物；
(f5)将权利要求1-3任一所述的单链抗体或其抗原结合部分进行修饰和/或改造后得到的抗体；
(f6)含有权利要求1-3中任一所述的重链...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，谢三磊，温凯，沈建忠，王战辉，于雪芝，夏曦，李建成，史为民，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11