基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法。包括：1)根据小分子化合物M的结构，设计半抗原，合成免疫原，免疫实验动物；然后收集动物血清测定效价，选取效价高的免疫动物提取B淋巴细胞；2)将B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂合杂交瘤细胞；3)筛选阳性杂交瘤细胞并体外扩大培养；4)对阳性杂交瘤细胞进行转录组测序，获得抗体重链和轻链的编码序列，然后利用原核或真核表达系统，制备得到小分子化合物M的抗体。本发明专利技术有效解决了传统大鼠单克隆抗体腹水制备难以及兔瘤细胞来源受限的问题，最终获得高特异性、高灵敏度和高稳定性的单克隆抗体，该方法在科研与实际应用中具有十分广阔的前景。

High throughput sequencing and hybridoma technology based antibody preparation of small molecular compounds

【技术实现步骤摘要】
基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法
本专利技术涉及免疫学和基因工程
，具体地说，涉及一种基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法。
技术介绍
自1975年Kohler和Milstein建立杂交瘤技术后，单克隆抗体的研制及应用迅速发展。但由于小鼠免疫系统不能识别鼠源性的免疫原，小鼠单抗的亲和性低于大鼠、兔等动物，并且小鼠腹水产生量少，因此相继产生了许多大鼠及兔单克隆抗体的制备研究。1979年后，陆续出现大鼠-大鼠单克隆抗体制备的相关研究。大鼠-大鼠杂交瘤技术较为成熟的方法是将LOU/C大鼠脾细胞与IR983F瘤细胞进行融合制备大鼠单克隆抗体。但经调研国内已没有LOU/C大鼠，从国外引进流程较为繁琐，并且LOU/C大鼠的繁育较为复杂，增加了大鼠单克隆抗体的制备难度。随着单抗技术的发展，美国Epitomics公司制备了兔的瘤细胞，成功获得了兔单克隆抗体，使兔单克隆抗体技术得以发展。但兔的瘤细胞在专利保护范围内，导致相应的兔骨髓瘤细胞系获取困难，限制了其在科研中的应用，使得该技术无法作为科研机构的实验平台被建立与推广。因此，用常规的方法制备大鼠和兔单克隆抗体具有一定的挑战性。转录组测序的研究对象为特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA的总和，主要包括mRNA和非编码RNA。转录组研究是基因功能及结构研究的基础和出发点，通过高通量测序，能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。本专利技术通过探索种间杂交瘤技术，成功获得了利用种间杂交瘤技术制备的杂交瘤细胞株并通过二代测序技术和原核表达技术获得了大鼠和兔单克隆抗体，搭建了大鼠-小鼠和兔-小鼠单抗制备平台。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法。本专利技术构思如下：基于SP2/0骨髓瘤细胞单克隆抗体技术和基于二代测序的转录组测序的生物分析技术发展已较为成熟，本专利技术尝试将莱克多巴胺作为靶标分子，利用莱克多巴胺(RAC)免疫原分别免疫Wistar大鼠和新西兰大白兔。取免疫后兔、大鼠的脾脏细胞分别与骨髓瘤细胞SP2/0融合，并对融合细胞进行培养增殖。通过对融合细胞进行筛选，获得可特异性识别小分子化合物的杂交瘤细胞株。利用二代测序技术对杂交瘤细胞的转录组进行测序。通过对转录组信息进行分析获得抗体重链和轻链的序列，设计特异性引物，对重链和轻链序列进行扩增，设计酶切位点，构建载体，导入大肠杆菌进行单克隆抗体的表达，通过鉴定从而获得兔和大鼠的单克隆抗体。此依托于高通量测序的杂合杂交瘤技术的发展对高亲和力小分子化合物抗体的筛选与制备具有深远的意义。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法，包括以下步骤：1)根据小分子化合物M的结构，设计免疫原，免疫实验动物；然后收集免疫动物的血清，测定效价，选取效价高的免疫动物提取B淋巴细胞；2)将步骤1)提取的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂合杂交瘤细胞；3)从杂合杂交瘤细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞并进行体外扩大培养；4)对阳性杂交瘤细胞进行转录组测序，获得抗体重链和轻链的编码序列，然后利用原核或真核表达系统，制备得到小分子化合物M的抗体；其中，步骤1)中所述实验动物不包括小鼠，所述实验动物优选大鼠、兔。本专利技术中，所述小分子化合物包括兽药分子、农药分子、真菌毒素、环境激素等分子量低于5000Da的化合物。所述B淋巴细胞可来自动物脾脏。优选地，所述小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0。优选地，步骤2)中利用聚乙二醇(如分子量为1450Da)进行细胞融合。前述的方法，步骤3)中进行阳性杂交瘤细胞体外培养使用的培养液的成分为：含1％HAT培养基添加剂和0.5％克隆补充物(HFCS)的DMEM高糖型完全培养液。其中，DMEM高糖型完全培养液是指含20％胎牛血清的80％DMEM高糖型不完全培养液。HAT培养基添加剂(50×)Hybri-Max，购自Sigma公司，所述HAT培养基添加剂为次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸苷(T)的液体混合物。DMEM高糖型不完全培养液为Gibco公司生产的DMEMbasic(1×)高糖培养液，货号C11995500BT。克隆补充物(HFCS)购自Sigma公司，HybridomaFusionandCloningSupplement(50×)，货号11363735001。当M为莱克多巴胺时(结构如式1所示)，对应的免疫原是由莱克多巴胺半抗原(Hapten1，结构如式2所示)与载体蛋白偶联后得到。其中，所述载体蛋白选自牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白等；优选牛血清白蛋白。第二方面，本专利技术提供按照上述方法制备得到的抗体。第三方面，本专利技术提供莱克多巴胺单克隆抗体12H8，所述单克隆抗体12H8包含如下的氨基酸序列或由其组成：i)、如SEQIDNO:1、2所示的重链和轻链氨基酸序列；或ii)、在i)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii)、i)或ii)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。第四方面，本专利技术提供莱克多巴胺单克隆抗体36E9，所述单克隆抗体36E9包含如下的氨基酸序列或由其组成：i′)、如SEQIDNO:3、4所示的重链和轻链氨基酸序列；或ii′)、在i′)的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或iii′)、i′)或ii′)的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体。第五方面，本专利技术分别提供编码上述两种单克隆抗体的核酸分子。第六方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。第七方面，本专利技术提供所述单克隆抗体12H8和/或36E9在制备莱克多巴胺检测试剂或试剂盒中的应用。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术提供的大鼠-小鼠、兔-小鼠杂合杂交瘤技术用于小分子化合物单克隆抗体的制备较为新颖，本方法制备步骤简单，成本较低，能够获得高特异性、高灵敏度的抗体。将传统的杂交瘤融合技术与成熟的测序技术相结合，避免了多次有限稀释法的亚克隆程序，可以快速制备得到单克隆抗体。该方法有效解决了传统大鼠单克隆抗体腹水制备难以及兔瘤细胞来源受限的问题，最终获得高特异性、高灵敏度和高稳定性的单克隆抗体，该方法在科研与实际应用中具有十分广阔的前景。附图说明图1为本专利技术实施例2中大鼠抗血清效价变化图。图2为本专利技术实施例2中兔抗血清效价变化图。图3为本专利技术实施例3中兔和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n1)根据小分子化合物M的结构，设计免疫原，免疫实验动物；然后收集免疫动物的血清，测定效价，选取效价高的免疫动物提取B淋巴细胞；/n2)将步骤1)提取的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂合杂交瘤细胞；/n3)从杂合杂交瘤细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞并进行体外扩大培养；/n4)对阳性杂交瘤细胞进行转录组测序，获得抗体重链和轻链的编码序列，然后利用原核或真核表达系统，制备得到小分子化合物M的抗体；/n其中，步骤1)中所述实验动物不包括小鼠，所述实验动物优选大鼠、兔。/n

【技术特征摘要】
1.基于高通量测序和杂合杂交瘤技术的小分子化合物抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)根据小分子化合物M的结构，设计免疫原，免疫实验动物；然后收集免疫动物的血清，测定效价，选取效价高的免疫动物提取B淋巴细胞；
2)将步骤1)提取的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，得到杂合杂交瘤细胞；
3)从杂合杂交瘤细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞并进行体外扩大培养；
4)对阳性杂交瘤细胞进行转录组测序，获得抗体重链和轻链的编码序列，然后利用原核或真核表达系统，制备得到小分子化合物M的抗体；
其中，步骤1)中所述实验动物不包括小鼠，所述实验动物优选大鼠、兔。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述B淋巴细胞来自动物脾脏；和/或
所述小鼠骨髓瘤细胞为SP2/0；和/或
步骤2)中利用聚乙二醇进行细胞融合。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中进行阳性杂交瘤细胞体外培养使用的培养液的成分为：含1％HAT培养基添加剂和0.5％克隆补充物的DMEM高糖型完全培养液。


4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，M为莱克多巴胺，对应的免疫原是由莱克多巴胺半抗原与载体蛋白偶联后得到；
所述莱克多巴胺半抗原的结构如下：



所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王战辉，沈建忠，温凯，江海洋，于雪芝，余文博，李红芳，段长飞，史为民，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11