靶向打靶载体及靶向整合外源基因至小鼠F4/80外显子22位点构建BAC克隆的方法和应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种靶向打靶载体及靶向整合外源基因至小鼠F4/80外显子22位点构建BAC克隆的方法和应用，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.14所示，命名为载体F4/80 5HA‑IRES‑DTR‑PGK‑EM7‑Neo‑F4/80 3HA。本发明专利技术提供了一个新的能实现靶向整合的位点序列，利用该位点可构建靶向插入外源基因的打靶载体，并验证了利用该打靶载体能高效整合外源基因至小鼠F4/80 BAC克隆F4/80外显子22位点，后续得到的靶向插入外源基因的F4/80 BAC，可以用于构建靶向插入外源基因的小鼠胚胎干细胞，从而为构建转基因细胞系以及小鼠建立了基础。

Construction of BAC clone by targeting vector and integrating foreign gene into exon 22 of F4 / 80 in mice

【技术实现步骤摘要】
靶向打靶载体及靶向整合外源基因至小鼠F4/80外显子22位点构建BAC克隆的方法和应用
本专利技术属于生物
，主要是一种靶向打靶载体及靶向整合外源基因至小鼠F4/80外显子22位点构建BAC克隆的方法和应用。
技术介绍
通过同源重组将外源基因定点整合至靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的，这种技术称为基因打靶技术。利用基因打靶技术将外源基因靶向整合至特定的染色体位点在基因疗法、细胞工程、遗传动物模型、基因功能研究及药物开发等中具有重要应用价值，而所有这些应用一方面依赖于转入基因功能的可靠性和可预测性，另一方面要求转入基因不影响内源基因和或其他调控因子的功能。F4/80又被称为含表皮生长因子样黏液素样激素受体样1(EMR1)，它广泛表达于许多髓系细胞，包括单核细胞、巨噬细胞，但不包括中性粒细胞。并且敲除F4/80不影响巨噬细胞的存活和功能。所以F4/80可以作为一个基因敲入的位点，使外源基因在单核巨噬细胞中特异性表达，在其他细胞中不表达，而且不会影响细胞的功能。细菌人工染色体(Bacteri本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种靶向打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.14所示，命名为载体F4/805HA-IRES-DTR-PGK-EM7-Neo-F4/80 3HA。/n

【技术特征摘要】
1.一种靶向打靶载体，其特征在于，所述靶向打靶载体序列如SEQIDNO.14所示，命名为载体F4/805HA-IRES-DTR-PGK-EM7-Neo-F4/803HA。


2.一种靶向打靶载体的制备方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
(1)以RP23-212F14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.1所示的正向引物和序列如SEQIDNO.2所示的反向引物进PCR，扩增出序列如SEQIDNO.3所示的基因片段F4/803’侧同源臂，即F4/803HA；
(2)将目的基因片段F4/803HA克隆至带阳性选择标记的载体PGK-EM7-Neo，得到中间载体PGK-EM7-Neo-F4/803HA；
(3)以pLVX-EF1α-IRES-mCherry质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.4所示的正向引物和序列如SEQIDNO.5所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.6所示的基因片段IRES；以pIRES-proHBEGFWT质粒为模板，利用序列如SEQIDNO.7所示的正向引物和序列如SEQIDNO.8所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.9所示的基因片段DTR；OverlapPCR得到序列如SEQIDNO.10所示的融合基因片段IRES-DTR；
(4)以RP23-212F14BACDNA为模板，利用序列如SEQIDNO.11所示的正向引物和序列如SEQIDNO.12所示的反向引物进行PCR，扩增出序列如SEQIDNO.13所示的基因片段F4/805’侧同源臂，即F4/805HA；

【专利技术属性】
技术研发人员：盛剑鹏，汤江辉，白雪莉，梁廷波，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属第一医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33