一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，包括以下步骤：构建自闭症蛋白相互作用网络；从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。本发明专利技术构建方法与传统模型构建方法相比，更系统科学，构建的敲除鼠经行为学检测表现出社交新异性受损、刻板的重复行为，满足自闭症临床症状，可用于自闭症发病的分子机理研究和治疗药物的开发。

A method of constructing animal model of autism by protein interaction network

【技术实现步骤摘要】
一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法。
技术介绍
自闭症谱系障碍(AutismSpectrumDisorder，ASD)是常见的神经系统发育失调导致的神经发育障碍，ASD患者往往表现为受损的社交，语言障碍(从语言滞后到言语缺失)，重复和/或强迫性行为和言语模仿症，多动症，记忆缺陷、学习、运动技能或其他神经功能异常兴奋，超低敏感的感官刺激、焦虑，适应新的环境和习惯困难。目前，研究自闭症主要是通过在啮齿类动物或非人灵长类动物中敲除某一热点基因，通过评估基因敲除后，动物表型特征的改变进而研究其发病机理。如在中国专利CN106172238B一种miR-124基因敲除小鼠动物模型中，专利技术人采用CRISPR技术构建了miR-124基因敲除鼠，该敲除鼠表现出明显的自主活动降低、学习记忆力下降、可溶性β淀粉样蛋白增多等神经系统疾病状态，为神经系统疾病病理研究、神经想通疾病药物的筛选提供了简单、可靠、经济的动物模型。如在中国专利CN109706184A自闭症模型犬的建立方法中，专利技术人采用CRISPR技术构建了Shank3基因敲除犬，该敲除犬弥补了小鼠及灵长类自闭症模型动物的缺陷，同时在基因缺陷模式上与人类具有较高的相似性，可用于人类自闭症治疗新技术的研究，新药开发及发病机制的研究。上述以及现有的自闭症敲除鼠，针对的都是已知的Shank3、NLGN3、NLGN4、CNTNAP2、NRXN1、NRXN2、PCD9等基因。但是自闭症基因包括少数的主效基因和许多的微效基因，上述的这些致病基因仅仅是在少数患者中发生突变的主效基因，单一基因突变就可以致病。此外，大多数自闭症患者的发病可能由多个微效基因和环境因素共同引起，每一微效基因突变都增加个体发病的易感性。因此，单一研究某一个基因对自闭症的影响不足以阐明其复杂的遗传异质性及其发病机制。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，所述方法科学合理，可靠性高，为自闭症及相关疾病的专利技术机制，药物筛选等研究提供了重要的参考。为了实现上述专利技术目的，本专利技术的技术解决方案是：一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，包括以下步骤：步骤①：构建自闭症蛋白相互作用网络；步骤②：从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；步骤③：从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；步骤④：利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。进一步地，所述步骤①具体方法为：：从数据库中获得自闭症候选基因，针对自闭症候选基因克隆转录剪接本；用转录剪接本编码的蛋白质与基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用，除去假阳性，验证，得到自闭症蛋白相互作用网络。进一步地，所述网络模块为神经突触传递模块和神经元胞内运输模块。进一步地，所述步骤③具体方法为：利用Jaccardindex计算进行模块分析，挑选边最多的基因作为关键节点。进一步地，所述关键节点为Gabra4、Gabrb1或Htr3a。进一步地，所述关键节点为Gabra4。进一步地，所述步骤④主要包括以下步骤：根据NCBI数据库上的Gabra4基因序列在第一外显子区域确定TALEN靶点；按照TALEN设计原则，设计得到TALEN识别序列；构建TALEN质粒，细菌转化；挑单克隆细菌培养，抽提质粒进行鉴定和测序验证；体外转录生成mRNA；将上述获得的mRNA注射到受精卵中；将受精卵注射到动物中；通过PCR和DNA测序分析对产生的F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定。进一步地，所述确定TALEN靶点是指对第一外显子区域中的序列进行删除、插入、置换或添加修饰。进一步地，所述确定TALEN靶点是指对第一外显子区域中的序列进行删除。进一步地，所述删除的序列为：GCCTGGCG，如SEQIDNO:1所示。进一步地，所述TALEN识别序列包括左臂识别序列和右臂识别序列，其中左臂识别序列为：TCGCCCTCCTGCACTTCC，如SEQIDNO:2所示；所述右臂识别序列为：TCCCCACCGAACTCACCA，如SEQIDNO:3所示。进一步地，所述测序中采用的测序正向引物序列为：5’-CGAGAGGCTGGAAACGTGAACA-3’，如SEQIDNO:4所示；反向引物序列为：5’-CTGAGTCTACTCGGTCAAAGGAAAGC-3’，如SEQIDNO:5所示。进一步地，所述动物为鼠。本专利技术另一目的在于提供上述方法构建得到的动物模型在研究自闭症发病机理中的用途。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术以自闭症蛋白相互作用网络为基础，筛选与自闭症相关的网络模块，通过分析得到模块中的关键节点，进一步对节点中的关键基因采用TALEN技术进行敲除得到相应的自闭症关键基因敲除鼠。与传统模型构建方法相比，该方法更系统科学，构建的敲除鼠经行为学检测表现出社交新异性受损、更强的认知能力、更好的空间记忆能力及明显的抗癫痫行为表型，对阐明自闭症发病的分子机理，为自闭症的诊断和治疗提供重要的理论依据。附图说明图1为本专利技术自闭症动物模型构建流程图；图2为DNA测序结果；图3为三厢社交行为测试实验结果；图4为自我修饰实验结果；图5为Y迷宫实验结果；图6为Morris水迷宫实验结果；图7为PTZ易感实验结果。具体实施例方式以下通过实施例形式的具体实施方法，对本专利技术的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下实施例。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例自闭症小鼠模型构建本实施例的自闭症小鼠模型构建流程如图1所示，具体包括以下步骤：一、构建自闭症蛋白相互作用网络从数据库中获得191个自闭症候选基因(基因列表如下表1所示)，针对上述191个自闭症候选基因从胎儿和成人脑组织中克隆了约422个各种转录剪接本(spliceisoform)；用上述422个转录剪接本编码的蛋白质与13000基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用。对初步测试结果，重复四次以除去假阳性，然后用哺乳动物蛋白-蛋白相互作用捕获技术(MammalianPPItrapassay,MAPPIT)进行验证，得到高质量的自闭症蛋白相互作用网络(具体可参见Proteininteractionnetworkofalternativelysplicedisoformsfrombrainlinksgeneticriskfactorsforautism，NatureCommunications，公开日2014年4月11日)。表1191个自闭症候选基因列表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤①：构建自闭症蛋白相互作用网络；/n步骤②：从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；/n步骤③：从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；/n步骤④：利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种利用蛋白质互作网络构建自闭症动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤①：构建自闭症蛋白相互作用网络；
步骤②：从上述网络中筛选与自闭症相关的网络模块；
步骤③：从筛选得到的网络模块中找到与自闭症相关的关键节点；
步骤④：利用基因编辑技术获得关键节点基因敲除型自闭症动物模型。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤①具体方法为：从数据库中获得自闭症候选基因，针对自闭症候选基因克隆转录剪接本；用转录剪接本编码的蛋白质与基因编码的蛋白质进行两两酵母双杂交，测试蛋白质相互作用，除去假阳性，验证，得到自闭症蛋白相互作用网络。


3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述网络模块为神经突触传递模块和神经元胞内运输模块。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤③具体方法为：利用Jaccardindex计算进行模块分析，挑选边最多的基因作为关键节点。


5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述关键节点为Gabra4。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤④主要包括以下步骤：根据NCBI数据库上的Gabra4基因序列在第一外显子区...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨新平，范翠霞，高玥，梁关梅，黄浪，王静，杨小雪，迟雅丽，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44