基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供了一种基于数字PCR无创产前筛查21‑三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法。本发明专利技术根据人类第21号染色体基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测目标基因；同时，根据人类第2、8号染色体基因序列设计扩增引物和taqman探针，检测参照基因；并基于数字PCR技术和数据分析，得出待测样本的21号染色体数目是否存在异常的检测结果。本发明专利技术所提供的检测方法相比于二代测序，操作简单、无需建库和测序等步骤，数据分析简单易学，大规模检测速度快，且检测成本较低，便于常规临床实验室开展。

Primers, probes, kits and methods for noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 21 syndrome based on digital PCR

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法
本申请涉及数字PCR
，尤其涉及一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法。
技术介绍
我国已成为出生缺陷的高发国，平均每年新增出生缺陷患儿高达120万，约占每年新增人口总数的4-6％，其中染色体异常性疾病是主要的疾病之一。这类疾病目前尚无有效的治疗方法，关键在于预防，即进行产前筛查和诊断。染色体异常性疾病是指染色体的数目异常和/或形态结构变化，可发生于每一条染色体上。其中，又以21三体(唐氏综合征)、18三体(爱德华氏综合征)和13三体(帕陶氏综合征)三种常染色体非整倍体最为常见，在新生儿中的发病率分别为1/800，1/8000，1/25000。目前，检测染色体非整倍体的疾病的方法有多种，通常使用羊膜穿刺来诊断胎儿遗传异常，但是羊膜穿刺术是侵入性的测试方法，可能引起感染和流产。近年来，基于二代测序检测孕妇血液中胎儿DNA，从而实现无创筛查遗传异常的方法被广泛应用，但存在检测费用高、检测流程长等问题。
技术实现思路
鉴于
技术介绍
中存在的问题，本申请的目的在于提供一种基于数字PCR技术无创产前检测21-三体综合征的引物、探针、试剂盒及方法。为了达到上述目的，本申请的第一方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物组合，包括：根据人类第21号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：12所示；分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：26所示。本申请的第二方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的探针组合，包括：根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：13～SEQIDNO：18所示；分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：27～SEQIDNO：30所示。优选地，上述探针组合中，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM、HEX或ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用AlexaFluor700标记。本申请的第三方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的试剂盒，包括：根据人类第21号染色体的检测位点设计的用于扩增和检测目标基因的特异性引物和Taqman探针；分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的用于检测参照基因的特异性引物和Taqman探针；其中，所述用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：18所示；所述用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：30所示。优选地，在上述基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的试剂盒中，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM、HEX或ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用AlexaFluor700标记。本专利技术的实施方式中所选择的人类第21号、第8号、第2号染色体的检测位点，以及设计的用于扩增和检测目标染色体、参照染色体的特异性引物和Taqman探针如下表1所示。引物及探针的设计原则为：采用primerexpress3.0.1对筛选到的序列进行引物和探针设计，引物退火温度在59℃左右，探针退火温度在68℃左右，不易形成二聚体和发夹结构，GC含量正常，检测的扩增范围在65-100bp，并进行引物和探针特异性检测。表1特异性引物和Taqman探针本申请的第四方面提供了一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的方法，包括如下步骤：(1)从待测样本孕妇外周血中获得游离DNA，作为待测基因组DNA；(2)选择人类第21号染色体的检测位点，设计用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针；选择人类第8号、第2号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针；其中，所述用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：18所示；所述用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：30所示；(3)配制数字PCR扩增反应体系，以步骤(1)所述的待测基因组DNA为模板，利用步骤(2)所述的特异性引物和Taqman探针进行数字PCR扩增和检测；(4)根据数字PCR的荧光信号，分别得到待测样本的第21号染色体的拷贝数a21和参照染色体的拷贝数b；其中，参照染色体的拷贝数b为待测样本的第2号染色体的拷贝数b2和第8号染色体的拷贝数b8的平均值；(5)计算待测样本第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比y21；(6)计算待测样本的第21号的Z-score：其中，y0为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的平均值；σy为三体综合征阴性样本的第21号染色体的拷贝数a21占该样本参照染色体的拷贝数b的百分比的标准差；(7)根据待测样本的第21号染色体的Z-score值判断待测样本的第21号染色体数目是否存在异常。优选地，在本申请的实施方式所提供的检测方法中，当(Z-score)21≤1.96时，表明待测样本的21号染色体数目正常；当1.96＜(Z-score)21≤3时，重新检测；当(Z-score)21>3时，表明待测样本的21号染色体数目存在异常。优选地，在本申请的实施方式所提供的检测方法中，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM、HEX或ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用AlexaFluor700标记。优选地，在本申请的实施方式所提供的检测方法中，所述数字PCR扩增反应的体系组成为：10×dPCRBuffer：3.5μL；酶：1.0μL；引物和探针：2.8μL；检测模板：1.0～17.5μL；总体积：用无核酶水补至30～35μL。优选地，在本申请的实施方式所提供的检测方法中，所述数字PCR扩增反应的程序为：50℃：10分钟、1循环；90℃：10分钟、1循环；95℃：20秒，59℃：40s，45循环；25℃保持。相对于现有技术而言，本专利技术提供了一种基于数字PC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物组合，其特征在于，包括：/n根据人类第21号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：12所示；/n分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：19～SEQ ID NO：26所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的引物组合，其特征在于，包括：
根据人类第21号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：12所示；
分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：26所示。


2.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的探针组合，其特征在于，包括：
根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：13～SEQIDNO：18所示；
分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针，所述Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：27～SEQIDNO：30所示。


3.根据权利要求2所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的探针组合，其特征在于，根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM、HEX或ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用AlexaFluor700标记。


4.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的试剂盒，其特征在于，包括：
根据人类第21号染色体的检测位点设计的用于扩增和检测目标基因的特异性引物和Taqman探针；
分别根据人类第8号、第2号染色体的检测位点设计的用于检测参照基因的特异性引物和Taqman探针；
其中，
所述用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：1～SEQIDNO：18所示；所述用于扩增和检测参照染色体的特异性引物和Taqman探针的核苷酸序列如SEQIDNO：19～SEQIDNO：30所示。


5.根据权利要求4所述的基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的试剂盒，其特征在于：
根据人类第21号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用FAM、HEX或ROX标记；根据人类第8号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用CY5标记；根据人类第2号染色体的检测位点设计的Taqman探针采用AlexaFluor700标记。


6.一种基于数字PCR无创产前检测胎儿21-三体综合征的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)从待测样本孕妇外周血中获得游离DNA，作为待测基因组DNA；
(2)选择人类第21号染色体的检测位点，设计用于扩增和检测目标染色体的特异性引物和Taqman探针；选择人类第8号、第2号染色体的检测位点，分别设计用于扩增和检测参照染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁军，景奉香，吴东平，
申请(专利权)人：江苏圣极基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32