一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准制造技术

本发明专利技术公开了一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、和5.7kb，各个片段中均包括能与针对于FMR1基因的探针结合的片段，且均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。本发明专利技术为southernblot印迹杂交技术对脆性X综合征进行诊断提供了一种特定的DNA分子量标准，实现对临床检测样本型别进行准确快速的判断。在‑20±5℃条件下保存3年仍然可以正常使用，不影响检测结果。且易制备、在贮存和使用过程中具有良好的稳定性和可重复性；无生物传染性。

A DNA molecular weight standard for the detection of fragile X syndrome by Southern blot

【技术实现步骤摘要】
一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准
本专利技术涉及分子生物学
，更具体地，涉及一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准。
技术介绍
脆性X综合征(FXS)是以生长发育落后和精神发育迟滞为主要表现的遗传疾病。近年的研究还发现，FXS也是导致孤独症谱系障碍(ASD)的重要原因。脆性X综合征的发病率仅次于唐氏综合征(21三体)，据统计，男性发病率约为1:4000，女性发病率为1:8000～1:6000。根据保守估计，我国至少有20万脆性X病人，主要特征为中度至重度智力低下，且随着年龄增加病情有加重的趋势，其他临床表现为特殊面容，如长脸或招风耳，青春期以后出现大睾丸，许多患者还表现为冲动、多动、焦虑、恐惧社交、语言呆板等孤独症行为。患者寿命与常人相同，但却不能独立生活，目前尚无有效治疗手段，只能通过特殊教育、技能训练及对症药物等综合手段，有限地提高患者的生活质量，给家庭和社会带来严重的心理和经济负担。FXS严重危害儿童生长发育，早发现，早治疗，也可为家系遗传提供产前遗传咨询，避免家族中再次出现同样的患者，对家庭幸福美满、社会人口素质提高有重大意义，具有不可估量的社会效益和经济效益。目前临床检测金标准为Southern印迹杂交方法，利用EcoRI和EagI限制性内切酶进行双酶切消化后，可以通过该方法检测出脆性X综合征相关基因FMR1前突变和全突变等位基因及嵌合体状态，同时可以了解甲基化状态，是最可靠的诊断方法。正常人DNA消化产物与探针杂交后，男性对应产生2.8kb大小的条带，女性有活性的X染色体对应产生2.8kb的条带，无活性的X染色体对应产生5.2kb的条带。男性携带者产生2.9～3.3kb的条带，而女性携带者的活性的X染色体对应产生2.9～3.3kb的条带，非活性X染色体对应产生5.3～5.7kb的条带。因此，2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb这6个长度片段对FMR1基因分型尤为重要，特别是接近2.9kb和5.2kb这两个区分野生型和发病类型临界位置的片段。目前针对Southernblot技术的分子marker均针对广泛项目，无可以区分这几种型别的条带。但是在杂交分析中如果没有合适的DNA分子量标准，在对结果进行分析时会出现困难。比如女性携带者可能会出现两个大小不同的正常等位基因之间的分离程度可能与正常等位基因和突变前等位基因之间的分离程度相同，造成将携带者误判成正常者；或是对较小重复数的前突变的判断，如果没有较好的DNA分子量标准就会很难根据酶切片段大小判断基因型别。虽然国际上判断分子分型标准可通过多个未知样本检测，推测分子分型；但是缺乏准确性，而且考虑到样本采集的难易程度、生物安全性以及伦理问题，要持续制备以及用于大量的科研和临床实验显然是不合适的。现在缺乏一种稳定性和重复性好，无生物传染性，结果可靠的可以监控杂交效果并对样本可以进行准确分型判断的DNA分子量标准。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准。该DNA分子量标准包含有6个片段，分别为2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb，用于对脆性X综合征相关基因FMR1准确分型。本专利技术的第一个目的是提供一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准。本专利技术的第二个目的是提供任一所述的DNA分子量标准的制备方法。本专利技术的第三个目的是提供任一所述DNA分子量标准在脆性X综合征southernblot印迹杂交检测中的应用。本专利技术的第四个目的是提供任一所述DNA分子量标准在制备脆性X综合征southernblot印迹杂交检测试剂盒中的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术提供一种适用于southernblot印迹杂交对脆性X综合征进行诊断的DNA分子量标准，合成对应大小的DNA片段，每条片段都包含southernblot探针序列，可以与样本一样可以与探针进行杂交并显色；再将片段插入到载体中制备成质粒，后对组合质粒进行酶切，得到相应大小的片段。片段混合制成DNA分子量标准中，包含有6个片段分别为2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、5.7kb，用于监控杂交效果并可以对样本进行准确分型，所述6条DNA片段均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb，2.9kb，3.3kb，5.2kb，5.3kb，5.7kb，各个片段中均包括能与探针结合的片段。本专利并不限制各个片段能与探针结合的片段位于其片段的位置。优选地，各个片段能与探针结合的片段位于各片段的3’端。优选地，所述针对于FMR1基因的探针其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。更优选地，所述能与探针结合的片段的序列如SEQIDNO：13所示。最优选地，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示。优选地，SEQIDNO：1～6所示的DNA片段的拷贝数混合比例为1～3:2～4:1～3:1～3:2～4:1～3。为了让阴性和阳性样本的临界片段更明显些，适当增加相应片段的用量。更优选地，核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示的DNA片段的拷贝数混合比例为2:3:2:2:3:2。以上所述的DNA分子量标准的制备方法，包括以下步骤：S1.合成核苷酸序列如SEQIDNO：1～6所示的DNA片段；S2.将S1的DNA片段分别连入克隆载体，得到重组质粒；S3.将重组质粒进行酶切，得到含有S1的DNA片段的DNA片段；S4.将S3得到的DNA片段按照拷贝数比例混合并定容。优选地，步骤S2中，克隆载体为pEASY-T1。优选地，步骤S3中，酶切使用的酶为NotI限制性内切酶，BcuI(SpeI)限制性内切酶和BstXI限制性内切酶。优选地，步骤S4中，使用LowTEbuffer进行定容。优选地，步骤S4中，定容至终浓度为0.3～0.8ng/μL。更优选地，定容至终浓度为0.4ng/μL。本专利技术还要求保护以下内容：以上任一所述DNA分子量标准在脆性X综合征southernblot印迹杂交检测中的应用；以上任一所述DNA分子量标准在制备脆性X综合征southernblot印迹杂交检测试剂盒中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术在体外构建的包含探针序列的长片段质粒，根据载体上特定的酶切位点进行酶切，得到脆性X综合征野生型，以及前突变与全突变临界值对应大小的片段。为southernblot印迹杂交技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于脆性X综合征southern blot印迹杂交检测的DNA分子量标准，其特征在于，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、和5.7kb，各个片段中均包括能与探针结合的片段，所述探针为针对于FMR1基因的探针，所述6条DNA片段均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种适用于脆性X综合征southernblot印迹杂交检测的DNA分子量标准，其特征在于，所述DNA分子量标准含有6条DNA片段，其长度分别为：2.8kb、2.9kb、3.3kb、5.2kb、5.3kb、和5.7kb，各个片段中均包括能与探针结合的片段，所述探针为针对于FMR1基因的探针，所述6条DNA片段均不含有EagI或EcoRI的酶切位点。


2.根据权利要求1所述的DNA分子量标准，其特征在于，各个片段能与探针结合的片段位于各片段的3’端。


3.根据权利要求1所述的DNA分子量标准，其特征在于，所述针对于FMR1基因的探针其核苷酸序列如SEQIDNO：16所示。


4.根据权利要求3所述的DNA分子量标准，其特征在于，所述能与探针结合的片段的序列如SEQIDNO：13所示。

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英松，李明，杨旭，王文玉，孙玉婷，杨学习，梁志坤，
申请(专利权)人：广州市达瑞生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44