检测胎儿染色体异常的方法技术

本发明专利技术涉及检测胎儿染色体异常的新方法，特别是，本发明专利技术涉及三体性21(唐氏综合征)的检测，其包括约100 bp‑约150 bp的所分析片段大小的富集。本发明专利技术还涉及用于实施所述方法的试剂盒。本发明专利技术还涉及预测怀孕女性受试者体内的胎儿性别的方法。

The method of detecting fetal chromosomal abnormality

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测胎儿染色体异常的方法专利
本专利技术涉及一种检测胎儿染色体异常的新方法，特别是，本专利技术涉及三体性21(唐氏综合征)的检测，其包括所分析片段大小约100bp-约150bp的富集。本专利技术还涉及用于实施所述方法的试剂盒。本专利技术还涉及预测怀孕女性受试者体内胎儿性别的方法。专利技术背景唐氏综合征为一种相对常见的遗传障碍，每800名活产婴儿中约有一名受到影响。该综合征是由存在额外的全染色体21(三体性21，T21)引起，或不太常见地，由存在额外的该染色体的大部分引起。在活产婴儿也发生涉及其他常染色体的三体性(即T13或T18)，但比T21更罕见。通常，其中存在由额外染色体或由染色体缺陷引起的胎儿非整倍性的病症，在母体无细胞血浆DNA中的胎儿DNA分子群体产生失衡，这是可检测的。开发可靠的用于产前诊断胎儿染色体异常的方法已成为生殖保健的长期目标(Puszyk等人,2008,PrenatDiagn28,1-6)。基于通过羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛取样获取胎儿材料的方法为侵入性的，并且甚至是在熟练的临床医生手中也对妊娠带来不可忽视的风险。在目前的实践中，这种侵入性的诊断方法通常用于由于母体年龄或通过事先使用生化测试或超声波检查进行筛查而指征唐氏妊娠的可能性增加时。需要可靠的、适用于头3个月妊娠期的、快速返回结果的和廉价的非侵入性产前诊断(NIPD)方法。通过利用发现孕妇血浆中的无细胞DNA包含胎儿来源的成分，已经朝着实现这一目标取得了进展(Lo等人,1997,Lancet350,485-487)。无细胞血浆DNA(下文称为“血浆DNA”)主要由短DNA分子(80-200bp)组成，其中一般地5%-20%属于胎儿来源的，其余为母体的(Birch等人,2005,ClinChem51,312-320;Fan等人,2010,ClinChem56,1279-1286)。对于血浆DNA分子的细胞来源及其进入血液并随后从循环中清除的机制了解甚少。然而，普遍认为胎儿成分很大程度上是胎盘内的凋亡细胞死亡的结果(Bianchi,2004,Placenta25,S93-S101)。胎儿来源的血浆DNA分子的分数因情况而异，存在很大的个体差异。叠加于个体差异上的为胎儿成分随着孕龄的增加而增加的总体趋势(Birch等人,2005,同上;Galbiati等人,2005,HumGenet117,243-248)。胎儿成分可易于在妊娠早期，一般地早在第8周就可检测到。原则上，如果血浆中的无细胞胎儿DNA没有被母体成分稀释，那么通过与正常妊娠相比较，表征T21的额外染色体预期会导致源自该染色体的DNA分子过量50%。然而，取胎儿来源的无细胞血浆DNA成分的典型值为10%，则结果的失衡预期仅为5%，或者相对于正常妊娠为1.00，21号染色体来源的片段数量相对增加至1.05的值。在其中血浆DNA的胎儿成分小于或大于10%的值的情况下，母体血浆中的分子群体中21号染色体来源的分子数量失衡将相应地更小或更大。因此，对于T21进行诊断测试的基础为从母体血浆中获取DNA分子的核苷酸序列数据(“DNA测序”)。一旦从单个DNA分子获取了部分或完整的核苷酸序列信息，就必须应用生物信息学技术，以最简单地通过与一个或多个参考人类基因组进行比较，将单个分子指定给其来源的染色体。在涉及具有T21的胎儿的妊娠的情况下，可检测到分子群体的轻微失衡，因为21号染色体来源的分子数量超过正常妊娠所预期的数量。考虑到21号染色体仅占人类基因组的一小部分(少于2%)这一事实，为了从该染色体收集足够大量进行可靠诊断，必须对来自母体血浆的大量DNA分子进行随机采样、测序并根据生物信息学将其指定给特定染色体。以下两项所需的血浆DNA分子的总数小于对全部或大多数胎儿基因组采样所需的量，但其至少是数十万个分子：(1)特征在于从其来源的核苷酸序列信息，和然后(2)可靠地指定给染色体位置。所需的最小数量为构成母体无细胞血浆DNA分子群体的胎儿成分的血浆DNA分数的函数。一般地，数量介于一百万或几百万个分子之间。由于对来自特定染色体位置的DNA分子进行计数需要很高的定量准确性，因此应用该方法的挑战相当大。此外，来自母体血浆的DNA为基因组的混合物，在其中胎儿成分占小部分。这种定量技术问题性质上不同于鉴定DNA样品中特定基因座处的突变。鉴于对于足够大量的血浆DNA可获取一些核苷酸序列数据，和鉴于可以可靠地应用生物信息学方法将足够大量指定给其染色体来源，可应用统计方法来以统计置信度确定血浆DNA分子群体中是否存在染色体失衡。这种对来自母体血浆的DNA片段的随机样品(但该样品仅构成完整基因组的一小部分)进行测序的想法，为Fan等人,2008,ProcNatlAcadSciUSA105,16266-16271和Chiu等人,2008,ProcNatlAcadSciUSA105,20458-20463所述的NIPD方法学的基础。利用测序数据的一种明显方法为排除指定范围之外的所有片段，从而在计算机中增加胎儿分数。然而，这种方法将使大多数测序数据无用，并且需要显著增加所处理和测序样品的量。因此，可认为数字富集对于在常规实验室环境中使用是昂贵、低效且不切实际的。一种备选解决方案为在测序之前富集源自胎儿的DNA的比例。一般地已经由大小选择方法(去除约200bp或更大的片段)利用这种富集。这种方法具有有限的灵敏度和富集胎儿分数的能力。迄今为止，还没有描述使得能够从生物样品高度准确和精确地富集胎儿DNA的方法。因此，需要一种用于从生物样品富集胎儿DNA以检测胎儿染色体异常的高度准确、非侵入性且简化的方法。这种方法可提高针对常见染色体异常(比如三体性13、18和21)的非侵入性产前测试的性能。其也将显著提高检测小得多的染色体异常(比如微缺失)的能力，其中相对于更常见的染色体异常，目前的性能非常差。专利技术概述本专利技术的第一方面提供一种检测胎儿染色体异常的方法，其包括以下步骤：(a)从获自怀孕女性受试者的生物样品中分离核酸；(b1)选择120bp-135bp之间的核酸片段大小值用于最佳胎儿分数；(b2)分离大小在步骤(b1)中选择的片段大小值的20bp以内的核酸片段；(c)确定与目标染色体的目标区域对齐的所述片段的第一数量和确定与参考染色体内的一个或多个目标区域对齐的所述片段的第二数量；(d)计算第一和第二数量之间的比率或差异；(e)基于所述比率或差异确定所述目标染色体的胎儿异常的存在。本专利技术的第二方面提供一种预测怀孕女性受试者体内的胎儿性别的方法，所述方法包括以下步骤：(a)从获自怀孕女性受试者的生物样品中分离核酸；(b1)选择120bp-135bp之间的核酸片段大小值用于最佳胎儿分数；(b2)分离大小在步骤(b1)中选择的片段大小值的20bp之内的核酸片段；(c)确定与性染色体对齐的所述片段的第一数量，和确定与一个或多个参考染色体对齐的所述片段的第二数量；(d)计算第一和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测胎儿染色体异常的方法，其包括以下步骤：/n(a) 从获自怀孕女性受试者的生物样品中分离核酸；/n(b1) 选择120 bp-135 bp之间的核酸片段大小值用于最佳胎儿分数；/n(b2) 分离大小在步骤(b1)中选择的片段大小值的20 bp以内的核酸片段；/n(c) 确定与目标染色体的目标区域对齐的所述片段的第一数量和确定与参考染色体内的一个或多个目标区域对齐的所述片段的第二数量；/n(d) 计算所述第一和第二数量之间的比率或差异；/n(e) 基于所述比率或差异确定所述目标染色体的胎儿异常的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170331 GB 1705281.2;20171110 GB 1718623.01.一种检测胎儿染色体异常的方法，其包括以下步骤：
(a)从获自怀孕女性受试者的生物样品中分离核酸；
(b1)选择120bp-135bp之间的核酸片段大小值用于最佳胎儿分数；
(b2)分离大小在步骤(b1)中选择的片段大小值的20bp以内的核酸片段；
(c)确定与目标染色体的目标区域对齐的所述片段的第一数量和确定与参考染色体内的一个或多个目标区域对齐的所述片段的第二数量；
(d)计算所述第一和第二数量之间的比率或差异；
(e)基于所述比率或差异确定所述目标染色体的胎儿异常的存在。


2.如权利要求1定义的方法，其中所述胎儿染色体异常为选自以下的遗传变异：非整倍性、重复、易位、突变(例如点突变)、取代、缺失、单核苷酸多态性(SNP)、染色体异常、拷贝数变异(CNV)、表观遗传变化和DNA倒置。


3.如权利要求1定义的方法，其中所述目标染色体为13号染色体、18号染色体、21号染色体、X染色体或Y染色体。


4.如权利要求1-3的任何一项定义的方法，其中所述胎儿染色体异常为胎儿染色体非整倍性。


5.如权利要求4定义的方法，其中所述胎儿染色体非整倍性为三体性13、三体性18或三体性21。


6.如权利要求5定义的方法，其中所述胎儿染色体非整倍性为三体性21(唐氏综合征)。


7.如权利要求1-6的任何一项定义的方法，其中所述胎儿染色体异常为例如高达1Mb、高达5Mb、高达10Mb或高达20Mb或大于20Mb的染色体插入或缺失。


8.如权利要求1-7的任何一项定义的方法，其中所述目标染色体为染色体内的区域和所述参考染色体为与所述目标染色体相同的染色体内的区域。


9.如权利要求1-8的任何一项定义的方法，其另外包括针对怀疑含有所述胎儿染色体异常的基因组区域富集样品。


10.如权利要求1-9的任何一项定义的方法，其另外包括以下步骤：
(i)通过计算每个片段大小(s)为胎儿来源的概率(w)，将与目标染色体的目标区域对齐的每个片段进行大小加权；
(ii)通过计算每个片段大小(s)为胎儿来源的概率(w)，将与一个或多个参考染色体内的一个或多个目标区域对齐的每个片段进行大小加权；
(iii)通过将步骤(i)中获取的值求和，计算总目标加权计数(Nc目标)；
(iv)通过将步骤(ii)中获得的值求和，计算总参考加权计数(Nc)；
(v)计算在步骤(iii)和(iv)中获得的Nc目标和Nc值之间的比率或差异；和
(vi)基于所述比率或差异确定所述目标染色体的胎儿异常的存在。


11.一种预测怀孕女性受试者体内的胎儿性别的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从获自怀孕女性受试者的生物样品中分离核酸；
(b1)选择120bp-135bp之间的核酸片段大小值用于最佳胎儿分数；
(b2)分离大小在步骤(b1)中选择的片段大小值的20bp以内的核酸片段；
(c)确定与性染色体对齐的所述片段的第一数量和确定与一个或多个参考染色体对齐的所述片段的第二数量；
(d)计算所述第一和第二数量之间的比率或差异；
(e)基于与所述参考染色体相比较是过多还是等同的片段与X染色体对齐或者是否存在Y染色体来确定所述胎儿的性别。


12.如权利要求11定义的方法，其另外包括以下步骤：
(i)通过计算每个片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：F克雷亚，M福尔曼，M里斯利，R舍尔默迪恩，
申请(专利权)人：普莱梅沙有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB