检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及分子学生物检测领域，更具体的，涉及检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的检测领域。本发明专利技术提供了一种寡核苷酸组合在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途，其可特异性地检测CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因拷贝数变异中的一种或更多种，与此同时，本发明专利技术还提供了所述寡核苷酸对组合物、包含所述寡核苷酸对组合物的试剂盒以及用于检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的方法。

Composition, kit and method for detecting CYP2D6 gene polymorphism and copy number

【技术实现步骤摘要】
检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的组合物、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学检测领域，具体地，涉及CYP2D6基因多态性和拷贝数的检测领域。
技术介绍
CYP2D6是第一个被确认由单基因控制的P450酶，CYP2D6是位于第22号染色体上，其含有9个外显子和8个内含子，总长5400bp左右，是一个完整的功能性基因。有研究发现，CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为CYP2D7P基因和CYP2D8P基因，CYP2D7P基因与CYP2D6基因有97％的核酸序列同源性，而且带有TATA盒，但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶(T)，从而改变了读码框架，使转录提前终止；CYP2D8P基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人体足迹中均不表达，只有CYP2D6在肝、肠、肾和人脑中表达。现代研究发现，肝脏中CYP2D6的含量仅占P450肝脏蛋白总量的2％，但是它却参与代谢约25％的临床用药，包括抗抑郁药、抗心律失常药、抗精神病药和镇痛药等。目前已发现超过100种CYP2D6等位基因的变异，主要包括单核苷酸变异、大片段基因的丢失以及拷贝数变异。为了简化基因型解释和提高表型预测，临床药物基因组学实施联盟(CPIC)根据“activityscore”(AS)ystem将等位基因的活性分数分为全功能型等位基因(分数值1)，功能减少型等位基因(分数值0.5)，无功能型等位基因(分数值0)，将所有等位基因活性分数相加得到AS值，根据AS值评估各类CYP2D6型别人群的活性分数确定PM(弱代谢型，AS值0)、IM(中间代谢型，AS值＝0.5)、EM(正常代谢型AS值1-2)和UM(超快代谢型AS值>＝2)4种代谢类型。CYP2D6基因的两种正常基因型为CYP2D6*1和CYP2D6*2，其中CYP2D6*2为C2850T突变。中国人群中五种常见突变基因型为CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*10和CYP2D6的基因拷贝数变异。CYP2D6*3为A2549del缺失突变，CYP2D6*4为C100T和G1846A共同突变，CYP2D6*5为整个基因缺失突变，CYP2D6*10为C100T突变，此外还有整个基因的拷贝数变异。目前测量CYP2D6基因多态性和拷贝数的方法主要有PCR荧光定量、直接测序法、PCR-单链构象多态性分析(SSCP)检测，液相和固相芯片法等。直接测序法、PCR-单链构象多态性分析检测无法检测拷贝数变异，目前的PCR法仅检测多态性或者拷贝数变异的其中一种，且由于假基因同源性高的原因灵敏度低。而液相或固相芯片法能够同时检测多态性和拷贝数变异，但需要采购配套的液态或固态芯片耗材以及专用的芯片读取仪器，需要合成探针芯片，成本高，且需要和其它基因一起设计，探针芯片不能太少，不能单独用来检测CYP2D6，灵敏度均不高，检测结果可重复性差。因此，本领域需求一种能够同时检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数，并且灵敏度高，不需要专用的仪器，以及成本低的产品。
技术实现思路
有鉴于此，在第一方面，本专利技术提供了一种寡核苷酸对组合物在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途，所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQIDNO:1～5所示；所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQIDNO:6～10所示；在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。所述测序引物和所述标签序列是本领域技术人员根据所选择的具体测序平台能够通过常规方法所确定。所述标签序列是4-12个N碱基，例如可以是8个N碱基。标签序列的目的是通过分子溯源，还原原始分子，例如如果同一起点和终点的相同序列，这个分子标签序列一致，则判为同一分子，不同分子标签序列，则为不同分子，进而能够去除PCR扩增偏倚，提高准确性，利于准确的判断拷贝数。在一个具体实施方案中，当使用Illumina平台时，其测序引物可以是例如，ACACGACGCTCTTCCGATCT。使用本专利技术的组合物能够同时检测CYP2D6基因的多态性和拷贝数，并如实施例所示，本专利技术的组合物对57例样品进行检测，分别检测出了CYP2D6基因的多态性和拷贝数，不需要专用的仪器，成本低。进一步地，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQIDNO:11所示的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQIDNO:12所示的序列。通过使用上述序列，能够使得以RPP30对应的扩增子(2倍体)为基准参照，通过CYP2D6与RPP30的分子数的比较能够更准确的推断CYP2D6的拷贝数。在第二方面，本专利技术还提供了一种寡核苷酸对组合物，其包括：所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：GAGAACAGGTCAGCCACCACTATGCA(SEQIDNO:1)，GCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACA(SEQIDNO:2)，GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGA(SEQIDNO:3)，CCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAA(SEQIDNO:4)，GGGGTCACCAGGAAAGCAAAGACA(SEQIDNO:5)；所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：CAGGTTCTCATCATTGAAGCTGCTCTC(SEQIDNO:6)，GGATGACCTGGGACCCAGCCCAG(SEQIDNO:7)，GTAGCGTGCAGCCCAGCGTTGGC(SEQIDNO:8)，GACGCCCCTTTCGCCCCAACGGT(SEQIDNO:9)，CCATGGTGGCTGGGCCGGGGC(SEQIDNO:10)；在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。进一步地，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQIDNO:11所示的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种寡核苷酸对组合物在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途，所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，/n所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:1～5所示；/n所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQ ID NO:6～10所示；/n在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。/n

【技术特征摘要】
1.一种寡核苷酸对组合物在制备检测CYP2D6基因多态性和拷贝数的试剂盒中的用途，所述寡核苷酸对组合物包括所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQIDNO:1～5所示；
所述寡核苷酸对的负向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为如SEQIDNO:6～10所示；
在所述寡核苷酸对的正向引物组和/或所述寡核苷酸对的负向引物组中的第一区域和第二区域之间进一步包括第三区域，所述第三区域为标签序列，在所述寡核苷酸对的负向引物组中的第二区域的5’端具有磷酸化修饰。


2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述寡核苷酸对的正向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQIDNO:11所示的序列，所述寡核苷酸对的负向引物组进一步包括第二区域序列为如SEQIDNO:12所示的序列。


3.一种寡核苷酸对组合物，所述寡核苷酸对组合物包括：所述寡核苷酸对的正向引物组和负向引物组；其中，
所述寡核苷酸对的正向引物组中的每一个从5’端至3’端包括：第一区域、第二区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：
GAGAACAGGTCAGCCACCACTATGCA(SEQIDNO:1)，
GCTGGATGAGCTGCTAACTGAGCACA(SEQIDNO:2)，
GGCAGTGGCAGGGGGCCTGGTGA(SEQIDNO:3)，
CCTTACCCGCATCTCCCACCCCCAA(SEQIDNO:4)，
GGGGTCACCAGGAAAGCAAAGACA(SEQIDNO:5)；
所述寡核苷酸对的负向引物组的每一个从5’端至3’端包括：第二区域、第一区域，其中，所述第一区域为测序引物，所述第二区域的序列分别为：
CAGGTTCTCAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：左中和，李金良，陈明，刘让蛟，戴立忠，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43