检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，包括用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组。本发明专利技术还公开了一种检测家族性地中海热单基因病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测家族性地中海热单基因病的扩增引物组和延伸引物组。此外，本发明专利技术还公开了一种检测家族性地中海热单基因病的方法。采用本发明专利技术的引物组进行检测家族性地中海热单基因病的方法，检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，且操作便利，检测灵敏度高，节省时间，检测成本大大降低，适合批量筛查。

Primer set, kit and method for detection of familial Mediterranean fever

【技术实现步骤摘要】
检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法
本专利技术属于基因检测
，特别涉及一种检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法。
技术介绍
家族性地中海热(familialMediterraneanfever，FMF)是一种常染色体隐性遗传性疾病，属于单基因自身炎症性疾病，临床表现为反复发作性发热伴腹膜炎、胸膜炎、滑膜炎和下肢丹毒样皮疹。长期反复发作的炎性反应会导致肾脏淀粉样变。典型的FMF发作每次持续小于3d，发作频率从每周1次至每年数次不等。口服秋水仙碱有效，并能预防淀粉样变。FMF的致病基因MEFV位于第16号染色体短臂，编码含781个氨基酸的蛋白称为炎素(pyrin)，炎素对于炎性反应的发生具有抑制作用。FMF累及全球约100000例患者，大多数是地中海裔人群，包括土耳其人、阿拉伯人、亚美尼亚人和犹太人。最常见的MEFV基因突变有5种:M694V、V726A、M680I、M694I(以上4种位于外显子10)及E148Q(位于外显子2)，占所有FMF基因突变的74％。但是，近几年在其他国家和种族出现了越来越多的FMF病例报道，如美国和日本。以同属亚洲的日本人为例，最早于2002年报道了FMF患者，此后陆续又有许多病例报道，其中包括1项全国调查问卷病例，总共80例。这项研究表明，日本FMF患者临床症状较地中海裔人群更轻微，淀粉样变发生率更低，基因突变类型也不同。目前，已有许多FMF诊断标准被应用于临床，但目前所共识的诊断标准都是基于地中海裔人群所设立的，亚洲人可能不一定完全符合该诊断标准，因此中国人FMF发病率极大可能被低估。尽管FMF仍被视为一种罕见病，但临床医生仍需迫切提高对本病的认识，最大程度地避免漏诊和误诊。依赖科学技术的发展，目前单基因病的诊断以二代测序为主，但其操作步骤繁复、检测时间长、对技术人员操作及分析能力要求较高，这些容易对检测结果的可靠性产生影响，同时二代测序检测试剂及分析耗材昂贵，较高的成本给其在二代测序疾病分子诊断及人群筛查中的应用带来诸多挑战，影响了应用的普及。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的在于提供一种检测家族性地中海热单基因病的引物组、试剂盒和方法；利用该引物组的检测方法所得检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，检测成本大大降低，适合批量筛查。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术通过以下技术方案实现：一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，包括用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的一对或多对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。进一步地，上述引物组包括用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的全部的27个延伸引物。本专利技术还提供了一种检测家族性地中海热单基因病的试剂盒，该试剂盒含有用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，该扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的一对或多对扩增引物，该延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。进一步地，该试剂盒含有的扩增引物组和延伸引物组用于检测用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的全部的27个延伸引物。进一步地，该试剂盒还包括PCR反应Taq酶和PCR缓冲液，PCR反应Taq酶、PCR缓冲液与所述扩增引物用于制备多重PCR扩增反应体系。进一步地，该试剂盒还包括SAP酶和SAP缓冲液，所述SAP酶和SAP缓冲液用于制备碱性磷酸酶处理反应体系。进一步地，该试剂盒还包括iPLEX酶和iPLEX缓冲液，该iPLEX酶、iPLEX缓冲液与所述延伸引物用于制备延伸反应体系。进一步地，该试剂盒还包括MassARRAY芯片。本专利技术还提供了一种检测家族性地中海热单基因病的方法，包括以下步骤：(1)获得用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物和延伸引物；(2)提取待检测样本的DNA；(3)以步骤(2)提取的DNA为模板，使用步骤(1)获得的扩增引物通过PCR扩增，获得目标序列扩增产物；(4)利用SAP酶除去步骤(3)获得的扩增产物中含有的游离的dNTPs；(5)以步骤(3)获得的目标序列扩增产物为模板，利用步骤(1)获得的延伸引物进行单碱基延伸反应，得到延伸产物；(6)纯化步骤(5)获得的延伸产物；(7)将纯化后的延伸产物采用飞行时间质谱基因分型系统进行检测和分型。本专利技术的有益效果是：本专利技术采用不同的引物设计软件，并结合agilentearraydesign探针设计系统，通过不断优化引物序列，最终将这27个突变位点的多重PCR扩增压缩至1个well(孔)中进行。采用本专利技术的引物组进行检测家族性地中海热单基因病的方法，检测结果准确，检测速度快，无需荧光标记，且操作便利，检测灵敏度高，节省时间，检测成本大大降低，适合批量筛查。具体实施方式下面对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。实施例一、引物设计本专利技术依据OMIM、clinvar等专业遗传数据库，并查阅相关数据库收集了中国人所常见的突变，共收集家族性地中海热单基因病突变位点27个，分别为：rs104895093、rs104895091、rs11466018、rs104895098、rs104895085、rs11466045、rs104895076、rs104895105、rs104895128、rs104895179、rs75977701、rs387907570、rs28940580、rs28940578、rs61752717、rs28940579、rs3743930、rs104895079、rs104895081、rs104895083、rs104895094、rs61732874、rs104895097、rs11466023、rs11466024、rs11466048、rs146820856。针对MassArray技术，如果将27个基因突变位点放在1个well中，就需要考虑通过实验条件不断优化引物。我们采用不同的引物设计软件，如Primrpremier、Oligo、VectorNTISuit、Dnasis、Omiga、Dnastar等，并结合agilentearraydesign探针设计系统，通过不断优化引物序列，得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，其特征在于，包括用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqID NO.1～54所示的一对或多对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如Seq IDNO.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，其特征在于，包括用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的一对或多对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。


2.根据权利要求1所述的一种检测家族性地中海热单基因病的引物组，其特征在于，包括用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点的扩增引物组和延伸引物组，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的全部的27个延伸引物。


3.一种检测家族性地中海热单基因病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有用于检测家族性地中海单基因病的扩增引物组和延伸引物组，该扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的一对或多对扩增引物，该延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的一个延伸引物或多个延伸引物。


4.根据权利要求3所述的一种检测家族性地中海热单基因病的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有的扩增引物组和延伸引物组用于检测用于检测家族性地中海单基因病的27个突变位点，其中，所述扩增引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.1～54所示的全部的27对扩增引物，所述延伸引物组包括核苷酸序列如SeqIDNO.55～81所示的全部的27个延伸引物。


5.根据权利要求3所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠丹，戴敬，李阳，赵洪玉，
申请(专利权)人：苏州恩科金生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32