用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的方法技术

本发明专利技术涉及一种同步检测SLCO1B1基因两个SNP位点的引物对及检测方法，有益于检测通量的提高。本发明专利技术先提供一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的引物对，包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。使用该引物对进行PCR扩增反应时，SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点同时进行扩增，即同时扩增包含2个SNP位点的4、5号外显子。本发明专利技术通过一次反应可以对SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点的基因多态性进行检测。可以同时检测90多例样本，不仅提高了检测效率，也很大程度的节约了成本费用。

A method for simultaneous detection of SLCO1B1 gene polymorphism at two SNP loci

【技术实现步骤摘要】
用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其是涉及用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的引物对及检测方法。
技术介绍
SLCO1B1基因长约109kb，位于12号染色体短臂上，由14个外显子和1个非编码外显子组成。它的主要功能是负责编码特异性分布于肝细胞基底膜外侧的有机阴离子转运蛋白OATP1B1。OATP1B1由691个氨基酸构成，分为14个跨膜区和1个大的第5胞外环，是肝细胞膜上的主要转运体之一，可介导各种内源性及外源性物质从血液进入肝细胞。它的靶向转运对多种药物的体内分布和肝清除具有重要作用。它通过增加肝细胞内药物的聚集，降低外周血血药浓度，减少外周非靶器官对药物的暴露，从而减轻其副作用。然而位于编码基因SLCO1B1跨膜区和第5胞外环区的非同义单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorplhisms，SNPs)可显著影响其编码的OATP1B1的转运活力。其机制可能为：可降低转运蛋白与底物的亲和力，导致其转运功能下降；使转运蛋白表达量降低；使肝细胞膜上转运蛋白的结构改变，使其转运功能改变。其中521T＞C突变主要降低其编码的OATP1B1与底物的亲和力，使其转运活性下降。临床上建议根据SLCO1B1基因型选择他汀类药物进行治疗。因此，人类SLCO1B1基因多态性检测，可辅助医生对他汀类药物使用剂量、毒性反应及疗效进行预测。SLCO1B1具有高度遗传多态性，40余个非同义单核苷酸多态性SNPs已经被发现。其中，研究最多也是亚洲人中最常见的2个非同义突变为A388G和T521C。有研究发现在中国人群中388A＞G和521T＞C的突变率分别为73.4％和14.0％。2个非同义突变可组成4种单倍体型，分别为野生型SLCO1B1*1a(388A521T)、单突变型SLCO1B1*1b(388G521T)、单突变型SLCO1B1*5(388A521C)和双突变型SLCO1B1*15(388G521C)。388A＞G和521T＞C分别位于4号外显子和5号外显子上。PCR(PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应)已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。目前，可针对SLCO1B1基因的两个多态性位点388A＞G和521T＞C分别设计PCR检测试验，以进行基因突变情况的检测。由于每个PCR反应只针对一个SNP位点，故检测通量较低。
技术实现思路
为了解决上述缺陷，本专利技术的技术目的是提供一种同步检测SLCO1B1基因两个SNP位点的引物对及检测方法，有益于检测通量的提高。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：首先提供一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的引物对，包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.2所示。本专利技术的引物对尤其是针对SLCO1B1的包含388A＞G和521T＞C位点的第4、5号外显子特异性扩增所特别设计的，可以同时同步、高效率、高特异性、准确地扩增出所述外显子在所述位点的一段特异性基因，再通过测序，检测其基因多态性。使用该引物对进行PCR扩增反应时，SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点同时进行扩增，即同时扩增包含2个SNP位点的4、5号外显子。可以最大程度地提高检测通量。经过多次试验证明，本专利技术提供的引物对具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制各同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出SLCO1B1基因在两个位点的基因多态性的结果，对于临床他汀类药物的选择做出指导。所述试剂盒，主要是包括本专利技术提供的引物对，其中引物的终浓度优选为20-300nM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)的混合物和超纯水。其中DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度均为50-500μM。DNA聚合酶可以选用Taq、KODFX等DNA聚合酶，如此，PCR缓冲液即为与所选用DNA聚合酶相对应的浓缩缓冲液，具体浓缩程度可选用2×、5×或10×。举例来说，选用KODFX这一DNA聚合酶，且选用2×的浓缩缓冲液时，为配置上述PCR反应体系，体系中各个组分的用量可以为：DNA聚合酶0.5～2μl、PCR缓冲液18～30μl、各种dNTP的混合物1～10μl、上下游引物各1-5μl、DNA5～1000ng，以及适量超纯水，以补水至50μl。以及可以为按照相同比例配置的其他体积大小。在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本专利技术的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样本。在本专利技术提供的引物对的基础上，本专利技术进一步提供一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的检测方法，采用所述的引物对进行PCR检测。根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；(2)配置包含所述引物对和所述扩增模板的PCR反应体系；(3)对所述PCR反应体系进行PCR扩增反应，得到PCR产物；(4)根据所述PCR产物，测定SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性。其中PCR扩增反应的最优选的反应条件为：94℃：1～10min；98℃：5～20s，58～68℃：10～60s，68～72℃：30s～5min，共25～40个循环；68～72℃：0～30min。在上述方法和条件的基础上，本专利技术的检测方法可以快速、有效、方便地同时同步得到待检测样品的SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性，最常见的是388A＞G和521T＞C。可用于非诊断目的。通常情况下，利用上游引物SEQIDNO.1和下游引物SEQIDNO.2来扩增SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点时，相应扩增产物的片段长度为2133bp。进而对该DNA片段进行切胶回收，并进行序列的测定。根据本专利技术的一个优选实施方式，所述步骤(4)测定基因多态性，包括：电泳检测所述PCR产物，以验证所述PCR产物的扩增片段大小；验证正确后对所述PCR产物进行序列测定，以获得所述待测样本的SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点的基因多态性情况。详细地，可用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳检测PCR扩增的片段。同现有技术相比，本专利技术至少具有以下有益效果：(1)提高检测通量：一般每个PCR反应只针对一个SNP位点，而本专利技术可以同时检测SL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的引物对，其特征在于，所述引物对包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQ ID NO.2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的引物对，其特征在于，所述引物对包含一对引物，上游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.1所示，下游引物的核苷酸序列由SEQIDNO.2所示。


2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述SNP位点是SLCO1B1基因的388A＞G和521T＞C位点。


3.权利要求1或2所述的引物对在制备用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的试剂盒中的应用。


4.一种用于同步检测SLCO1B1基因的两个SNP位点的基因多态性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物对。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含DNA聚合酶、PCR缓冲液、4种dNTP的混合物和超纯水。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶的用量为0.5-5U，每种dNTP的终浓度均为50-500μM，引物的终浓度为20-3...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵方圆，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：西安和合医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61