精神分裂症小鼠模型前额皮层circRNA测序分析试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物、检测方法及试剂盒。其为circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA10，上述标记物的检测方法及检测标记物含量的试剂盒；同时还提供了一种精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层干预的生物标记物，为circRNA3、circRNA10，上述标记物的检测方法及标记物含量试剂盒；提供circRNA3、circRNA10的信号通路‑靶基因网络图及前额皮层中差异circRNA3、circRNA10的GO/KEGG富集分析结果。本发明专利技术的有益效果在于佐证了小鼠孕期神经损害、出生后应激刺激可致精神分裂样模型，并首次发现其前额皮层circRNA具有表达水平差异性，该变化可被奥氮平干预所逆转。这对精神分裂症发病与表观遗传学的关系及寻找其新药具有重要意义。

A kit for the sequencing of circrna in the prefrontal cortex of schizophrenic mice

【技术实现步骤摘要】
精神分裂症小鼠模型前额皮层circRNA测序分析试剂盒
本专利技术属于生物
，涉及精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物、检测方法及试剂盒。
技术介绍
精神分裂症(schizophrenia,SZ)是一种在遗传和神经发育缺陷基础上产生的慢性、致残性精神障碍。然而直到目前为止，精神分裂症的诊断现状仍不能令人满意，例如诊断的主观性强、及时性不足等，而且由于此病的症状为非特异性，不易与其它精神疾病相鉴别。因此，临床上迫切需要探寻一种有效的生物标志物，来进一步提高精神分裂症诊断的准确性。随着分子生物学技术和遗传学数据分析方法的进步,精神分裂症易感基因方面的研究也取得了一定的进展。随着后基因组时代的来临,转录组学技术作为率先发展起来的新技术已得到广泛应用,其为研究基因功能及基因结构的重要手段,可将基因组遗传信息与症状学联系起来。环状RNA(circRNA)是区别于传统线性RNA的一类新型RNA，具有闭合环状结构，大量存在于真核转录组中。大部分的circRNA是由外显子序列构成，在不同的物种中具有保守性，同时存在组织及不同发育阶段的表达特异性；由于circRNA对核酸酶不敏感，所以比线性RNA更为稳定，这使得circRNA在作为新型临床诊断标记物的开发应用上具有明显优势。研究显示，circRNA在不同物种中起到miRNA海绵的作用，称之为竞争性內源RNA(ceRNA)，能竞争性结合miRNA，从而调控靶基因的表达，例如有研究发现的一个circRNA-CDR1as(也称为ciRS-7)，在其序列上有超过60个保守的miR-7结合位点，因此，起到有效的miR-7海绵作用，能够影响miR-7靶标基因活性。在斑马鱼实验中，该circRNA的表达能够损害中脑发育，与敲除miR-7效果一致。通过高通量测序和生物信息学分析手段，研究者在哺乳动物转录组中发现了数以千计的circRNA，说明circRNA很有可能就是一类新的调控型內源竞争性RNA(ceRNA)。这说明，circRNA可能通过竞争性结合疾病相关的miRNA在疾病调控中发挥着非常重要的作用。很多circRNA是由蛋白编码基因产生，但是还没有结果显示circRNA在细胞中编码蛋白，circRNA也因此被定义为一类新型非编码RNA。其主要通过“1个以上的外显子反向剪接成环”形成，是非线性的、自我环化的非编码RNA分子，常定位于细胞质中。circRNA分位于细胞质中富含miRNA结合位点，能结合并抑制miRNA，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，升高靶基因的表达水平。常规存在于线性RNA分子中的3’和5’端在circRNA中被连接形成了闭合环状结构。因此，circRNA具有高表达和稳定的特性，它在与其它线性內源竞争性RNA共同作用过程中能够显示异常突出的ceRNA活性。除了ceRNA活性，circRNA也有可能与RNA结合蛋白RBPs结合，或与其它RNA碱基互补结合甚至结合RNA的翻译蛋白，从而影响基因的正常功能。基于双重刺激神经发育假说建立的神经发育小鼠模型，是通过环境应激或药物刺激干扰神经发育的关键阶段，引起中枢神经系统发育的不可逆改变，继而引起动物成年后持久的行为改变，可模拟出精神分裂症的症状学特征。介于伦理学角度的约束及获取人脑组织的困难性，选择小鼠精神分裂症模型来研究精神分裂症的发病机制则成为必然。因此，本专利技术意在探讨精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层circRNA表达水平、检测方法及试剂盒。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物、检测方法及试剂盒。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下：精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物，所述标记物为circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA10。在本专利技术的第二方面，提供了上述精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物的检测方法，包括以下步骤：脑组织采集对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑，将小鼠脑腹面朝上放入冰袋预冷的小鼠脑冠状切片模具(037-001,HuaYueYangBiotechnology,Beijing,China)，用双面刀片将小鼠全脑切成1mm厚的冠状切片，将粘附有脑冠装片的刀片平铺于冰袋上。对照小鼠脑解剖图谱，参照Bregma位置找到AP(-1.3～-3.3)，用直径1mm平口针头戳取脑冠状片目标区域脑组织，浸入装有10ulRNA组织保存液RNAguarder(ZH0103-A,HuaYueYangBiotechnology,Beijing,China)的1.5ml离心管中，后移入-80℃冰箱冻存备用。RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent2100Bioanalyzer质检合格后，使用IlluminaHiSeqTM2500或其他测序仪测序。Real-TimePCR(RT-PCR)验证根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物。依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠前额皮层10个差异circRNA进行RT-RCR检测。每个circRNA样本平行重复3次。比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异的circRNA再在SZ组和Treated组样本中进行RT-PCR检测。在本专利技术的第三方面，提供了一种：精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标志物试剂盒，其能够测定circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA10表达水平。在本专利技术的第四方面，提供了一种精神分裂症神经发育小鼠模型转归的生物标记物，所述标记物为circRNA3、circRNA10。在本专利技术的第五方面，提供了上述精神分裂症神经发育小鼠模型转归生物标记物的检测方法：取适量抗精神病药(奥氮平)治疗后精神分裂症神经发育小鼠模型的前额皮层组织，从中提取总RNA，并进行正态化校正后进行逆转录反应；反应完成后进行实时荧光定量PCR，得到circRNA20表达水平。以选择经过测试在所有样本中可以稳定检测到的β-Actin作为RT-PCR实验内参，以ΔCt值(ΔCt＝Cttarget-Ctβ-actin)表示目标RNA的相对表达水平；使用FPKM法(FragmentsPerkbPerMillionReads)统计目标RNA表达量；采用NB(负二项分布检验)检验目标RNA差异显著性。通过建立circRN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物，其特征是，所述标记物为circRNA12、circRNA13、circRNA15、circRNA20。/n

【技术特征摘要】
1.一种精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物，其特征是，所述标记物为circRNA12、circRNA13、circRNA15、circRNA20。


2.一种权利要求1所述的精神分裂症神经发育小鼠模型前额皮层生物标记物的检测方法，其特征是，包括以下步骤：脑组织采集对照组(NC)、精神分裂症模型组(SZ)、治疗组(Treated)三组小鼠均于100天断头处死并剥离全脑。RNA抽提、建库提取样品总RNA，并使用试剂盒ribo-zero消化核糖体RNA后；加入打断试剂将RNA打断成短片段，以打断后的RNA为模板,用六碱基随机引物合成一链cDNA，然后配制二链合成反应体系合成二链cDNA，在cDNA二链合成时以dUTP代替dTTP,然后连接不同接头，再利用UNG酶法将含有dUTP的一条链进行消化，只保留连接链不同接头的cDNA一链；使用试剂盒纯化cDNA一链；纯化的cDNA一链再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后进行片段大小选择，最后进行PCR扩增；构建好的文库用Agilent2100Bioanalyzer质检合格后，使用IlluminaHiSeqTM2500或其他测序仪测序。Real-TimePCR(RT-PCR)验证根据测序结果及标准RNA序列，设计circRNA探针及引物。依据差异倍数FC≥2、聚类分析结果中处于不同簇、每个样本均能检测出三个条件分别挑选小鼠前额皮层10个差异circRNA进行RT-RCR检测。每个circRNA样本平行重复3次。比较NC组和SZ组的表达差异是否显著，选取有显著差异...

【专利技术属性】
技术研发人员：张理义，卢翠英，
申请(专利权)人：张弛，
类型：发明
国别省市：江苏;32