β-丙氨酸的生物合成方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及β‑丙氨酸的生物合成方法。本发明专利技术提供了能将丙烯酸转化为β‑丙氨酸的酶。以该酶进行β‑丙氨酸的生物合成，能够避免化学法涉及的高温、高压反应，且副反应得到了良好的控制；避免了丙烯腈的使用，丙烯腈毒性大，环境危害大，而本发明专利技术以丙烯酸为原料，不仅毒性小，对环境影响小；与现有的生物法相比，仅需一步反应，缩短了反应进程，24小时即可实现β丙烯酸的制备，提高了制备效率。

Biosynthesis of \u03b2 - Alanine

【技术实现步骤摘要】
β-丙氨酸的生物合成方法
本专利技术涉及生物
，尤其涉及β-丙氨酸的生物合成方法。
技术介绍
β-丙氨酸(β-Alanine)是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它是一种非蛋白氨基酸，主要用于合成泛酸、辅酶A、肌肽和鹅肌肽等物质，对生物体的生长和发育起着必不可少的作用。随着对β-丙氨酸及其衍生物的研究日趋成熟，如喜树碱β-丙氨酸酯、聚β-丙氨酸等，在医药、精细化工、环境等领域发挥越来越重要的作用。国内外生产β-丙氨酸有化学合成法与生物合成法：化学法合成β-丙氨酸路线生物法合成β-丙氨酸路线其中，化学合成法主要是丙烯腈法，是以丙烯腈和液氨为主要原料，在100～109℃，1Mpa压力下保温4h，生成β-氨基丙腈，β-氨基丙腈在90～95℃下碱解1h生成β-氨基丙酸钠，再用HCl中和，生产1吨β-丙氨酸大约需2吨NaOH和2吨HCl。该方法的原料丙烯腈易燃、高毒、对环境有严重危害、且价格较高。整个生产过程涉及高温、高压反应，能耗很大，同时有副产物生成，反应需要两步完成，过程复杂，强酸、强碱、原料及中间体对人和环境危害很大，并且其产品中含有一定的有害物质。反应产物中含有NaCl，需要反复精制才能得到高纯度的β-丙氨酸，否则Cl-的存在会大大影响产物质量。而生物合成法生产β-丙氨酸，主要是通过天冬氨酸酶与L-天冬氨酸-α-脱羧酶双酶偶联，催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸，而后脱羧生成β-丙氨酸。该方法的原料富马酸转化为β-丙氨酸时有分子量损失，原子经济性差；反应需要两步完成、过程复杂，影响收率；而且酶催化富马酸加氨合成L-天冬氨酸的反应为可逆反应，不能完全转化，收率低。进一步改进丙氨酸的合成工艺，既避免化学法的一系列危害，而克服现有生物法步骤长、经济性差的缺陷，仍是目前研究的热点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供β-丙氨酸的生物合成方法。本专利技术利用突变的酶，以丙烯酸为底物生成β-丙氨酸。本提供了能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。本专利技术所述的酶为突变的天冬氨酸酶。所述天冬氨酸酶(EC4.3.1.1)能够催化L-天冬氨酸生成富马酸的可逆反应。野生型天冬氨酸酶的活性口袋中，有4个能够与α-羧基相结合的位点，为极性氨基酸残基，通常为苏氨酸、蛋氨酸、赖氨酸和天冬酰胺。天冬氨酸酶目前广泛应用于天冬氨酸的生物法合成，并且是现有生物法合成β-丙氨酸第一步所需的酶催化剂。其性质与催化机理已经得到了广泛研究。天冬氨酸酶具有严格的底物特异性，只对富马酸表现出活力，文献报道与前期研究均表明，其对丙烯酸不存在催化活力。本专利技术选择天冬氨酸酶作为改造起点，在野生型天冬氨酸酶的基础上，通过人工引入突变，改变其催化性质，使其能够将丙烯酸作为底物生成β-丙氨酸。本专利技术所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸。一些实施例中，本专利技术所述的酶，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为异亮氨酸；野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为亮氨酸。一些具体实施例中，野生型天冬氨酸酶来源于芽孢杆菌YM55-1。一个具体实施例中，所述酶为来源于一种芽孢杆菌菌株YM55-1的天冬氨酸酶突变体，其至少包括如下突变之一：187位由苏氨酸突变为丙氨酸；321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸；324位由赖氨酸突变为异亮氨酸；326位由天冬酰胺突变为亮氨酸。具体的，所述酶为：芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸的突变体(记为T187A)；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突变体(记为M321F)；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体(记为K324I)；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体(记为N326L)；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体；芽孢杆菌YM55-1天冬氨酸酶的第187位由苏氨酸突变为丙氨酸、第321位由蛋氨酸突变为苯丙氨酸、第324位由赖氨酸突变为异亮氨酸、第326位由天冬酰胺突变为亮氨酸的突变体。含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体记为AFIL，的氨基酸序列如SEQIDNO:4。本专利技术实验表明，含有T187A、M321F、K324I、N326L突变位点之一的天冬氨酸酶突变体即可实现催化丙烯酸向β-丙氨酸的转变，转化率为15.2％～24.3％。而含有四个突变位点的天冬氨酸酶突变体能够使丙烯酸向β-丙氨酸的转化率达到99.8％。以其他物种来源的天冬氨酸酶为野生型酶进行突变，或引入突变位点，也能够实现丙烯酸向β-丙氨酸的转变，催化效率与本申请的效果相似甚至更高。...

【技术保护点】
1.能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。/n

【技术特征摘要】
1.能将丙烯酸转化为β-丙氨酸的酶。


2.根据权利要求1所述的酶，其特征在于，其为突变的天冬氨酸酶。


3.根据权利要求2所述的酶，其特征在于，下列位置至少由如下氨基酸之一组成：
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由苏氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由蛋氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由赖氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸；
野生型天冬氨酸酶的活性口袋中α-羧基结合位点由天冬酰胺突变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或半胱氨酸。
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【专利技术属性】
技术研发人员：周硕，赖敦岳，何龙丹，何梦燕，汪钱，
申请(专利权)人：台州酶易生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33