一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效利用淀粉生产L‑亮氨酸的方法，属于生物催化技术领域。本发明专利技术通过对棒杆菌属的L‑亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理，提高菌株对高温的耐受性。随后，在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物(如B.amyloliquefaciens)中α‑淀粉酶编码基因，在棒杆菌属的L‑亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径，从而改善了最适菌体生长温度与α‑淀粉酶最适作用温度不一致的的缺点，获得了高效利用淀粉生产L‑亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。

An efficient method of L-leucine production from starch

【技术实现步骤摘要】
一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法
本专利技术涉及一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，属于生物催化

技术介绍
L-亮氨酸是人和动物所需的八种必需氨基酸之一，因与L-缬氨酸和L-异亮氨酸同具有甲基侧链分支结构而统称为支链氨基酸。L-亮氨酸具有多种生理功能，广泛应用于食品工业，饲料工业和制药等工业。同时，L-亮氨酸在氨基酸静脉输液等方面的用量日益增长，是应用于临床氨基酸复合输液中不可缺少的原料之一，对维持病危病人的营养需求，抢救患者生命起着积极的作用。谷氨酸棒状杆菌是目前微生物发酵生产L-亮氨酸的主要工业菌株。然而，由于L-亮氨酸的合成途径长、反馈调控机制严格，所以其生产菌株的产量和转化率仍然较低，现阶段其产量已经无法满足日益增长的市场需求。因此，迫切需要研发构建以廉价底物为原料高效合成L-亮氨酸高产菌株。目前，国内外选育L-亮氨酸高产菌株的方法主要包括传统的物理-化学诱变、代谢工程调控、细胞重组技术以及基因工程技术等。选育L-亮氨酸高产菌株的主要思路有：①解除三种支链氨基酸对生物合成途径上的乙酰羟酸合成酶(AHAS)、乙酰羟酸异构还原酶(AHAIR)、二羟酸脱水酶(DHAD)等3个共用酶的协同反馈阻遏作用；②解除L-缬氨酸对AHAS的反馈抑制作用；③解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶(IPMS)的反馈抑制和阻遏作用，如选育L-亮氨酸和L-缬氨酸结构类似物抗性标记的突变株；④改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累，如选育某些药物类(如磺胺胍)或抗生素类(如利福平)抗性标记的突变株。虽然上述方法取得利率一定的成果，但是目前用于发酵生产L-亮氨酸的碳源全都采用葡萄糖。由于目前用于工业化生产L-亮氨酸的菌株其产量和转化率仍然较低，所以生长成本一直居高不下。如何采用廉价底物为唯一或主要原料生产L-亮氨酸，成为国内外氨基酸生产企业和氨基酸产生菌育种专家亟待需要解决的问题。众所周知，棒杆菌属的微生物只能利用少数几种糖类如葡萄糖、蔗糖、果糖和麦芽糖作为碳源用于菌体生长和合成某些代谢产物，其中葡萄糖是棒杆菌属的微生物偏好利用的碳源。对于大多数棒杆菌属的微生物来说，它们无法利用淀粉、纤维素等多糖，其原因是它们细胞内不存在分解利用这些多糖的酶。目前，虽有报道通过在谷氨酸棒杆菌中异源表达来自链霉菌属或链球菌属微生物中的α-淀粉酶可以实现以淀粉为唯一碳源合成氨基酸(如L-赖氨酸)，但产量无法与以葡萄糖为主要碳源相比，无法实现工业化应用。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，通过对棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理，提高菌株对高温的耐受性。随后，在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物中α-淀粉酶编码基因，在棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径，从而改善了最适菌体生长温度与α-淀粉酶最适作用温度不一致的的缺点，获得了高效利用淀粉生产L-亮氨酸的重组谷氨酸棒杆菌。本专利技术的第一个目的是提供一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，包括如下步骤：(1)将出发棒杆菌接种于LBG液体培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发棒杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ0，即μ＝χ0；(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发棒杆菌接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ1；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ2；重复上述步骤，直至菌株在34-36℃下比生长速率μ≈χ0，得到在34-36℃下正常生长的突变菌株；(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在34-36℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在39-41℃下正常生长的突变菌株；(4)采用步骤(2)相同方法，以步骤(3)得到的在39-41℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；(5)以步骤(4)得到的在44-46℃下正常生长的突变菌株为宿主菌，异源表达α-淀粉酶基因，得到能够表达α-淀粉酶的重组菌；(6)以淀粉作为唯一碳源，利用步骤(5)得到的重组菌发酵生产L-亮氨酸。进一步地，所述的棒杆菌为谷氨酸棒杆菌。进一步地，在步骤(1)中，所述的培养是在28-32℃，100-150r/min转速下培养。进一步地，在步骤(2)中，所述的培养是在100-150r/min转速下培养。进一步地，在步骤(5)中，所述的α-淀粉酶基因来源于解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌。优选来源于B.amyloliquefaciens。进一步地，在步骤(6)中，所述的发酵的具体步骤为：将重组菌单菌落接种至LBG培养基中培养至对数期，将种子培养液转接至改良发酵培养基进行发酵生产L-亮氨酸。进一步地，所述的改良发酵培养基为：可溶性淀粉40-50g/L，(NH4)2SO410-20g/L，CH3COONH410-20g/L，KH2PO42-4g/L，MgSO4·7H2O0.5-1.5g/L，MnSO4·4H2O0.05-0.15g/L，柠檬酸钠2-4g/L，尿素2-5g/L，L-蛋氨酸0.5-1.5g/L，L-谷氨酸0.5-1.5g/L，L-异亮氨酸0.05-0.15g/L，盐酸盐甜菜碱1-2g/L，生物素0.0003-0.0008g/L，硫胺素0.0005-0.0010g/L，CaCO330-50g/L。进一步地，种子培养阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为10-14h。进一步地，将种子培养液转接至发酵培养基的接种量为5-15％。进一步地，发酵阶段的培养条件为：培养温度为44-46℃，转速为100-150r/min，培养时间为60-80h。本专利技术的作用原理：在利用淀粉作为唯一碳源，发酵生产L-亮氨酸的过程中，淀粉需要分解成可发酵性糖如单糖或双糖，才能被有效利用。α-淀粉酶在采用酶法水解淀粉中发挥重要作用。根据最适作用温度不同，α-淀粉酶可以分为中温淀粉酶和高温淀粉酶，其中前者最适作用温度是50～70℃，后者最适作用温度是>90℃。然而，对于大多数棒杆菌属的微生物来说，它们的最适生长温度为25～37℃，由于酶的最适作用温度与菌体生长的最适温度不一致导致不能有效利用淀粉合成L-亮氨酸。本专利技术利用温度诱导适应性进化的方法，得到生长最适温度与酶的最适温度比较接近的菌株，并构建淀粉代谢途径，利用其以淀粉作为唯一碳源，发酵生产L-亮氨酸。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过对棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌进行温度诱导的适应性进化处理，提高菌株对高温的耐受性。随后，在此突变菌株基础上异源表达来源于芽孢杆菌属微生物(如B.amyloliquefaciens)中α-淀粉酶编码基因，在棒杆菌属的L-亮氨酸产生菌中构建了可高效利用淀粉的代谢途径，从而本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)将出发棒杆菌接种于LBG液体培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发棒杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ

【技术特征摘要】
1.一种高效利用淀粉生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将出发棒杆菌接种于LBG液体培养基中，在最适温度下进行培养，测定出发棒杆菌在最适生长温度下的比生长速率χ0，即μ＝χ0；
(2)将步骤(1)中生长至对数生长中后期的出发棒杆菌接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ1；进一步将上述生长至对数生长中后期的菌株接种至新鲜LBG液体培养基中，并在34-36℃进行培养，测定菌株在34-36℃下的比生长速率μ＝χ2；重复上述步骤，直至菌株在34-36℃下比生长速率μ≈χ0，得到在34-36℃下正常生长的突变菌株；
(3)采用步骤(2)相同方法，以步骤(2)得到的在34-36℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在39-41℃下正常生长的突变菌株；
(4)采用步骤(2)相同方法，以步骤(3)得到的在39-41℃下正常生长的突变菌株为出发菌株，诱导在44-46℃下正常生长的突变菌株；
(5)以步骤(4)得到的在44-46℃下正常生长的突变菌株为宿主菌，异源表达α-淀粉酶基因，得到能够表达α-淀粉酶的重组菌；
(6)以淀粉作为唯一碳源，利用步骤(5)得到的重组菌发酵生产L-亮氨酸。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的棒杆菌为谷氨酸棒杆菌。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述的培养是在28-32℃，100-150r/min转速下培养。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述的培养是在...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐建中，史可，王颖妤，章洁颖，郝宇晨，张伟国，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32