一种发酵生产L-亮氨酸的方法技术

本发明专利技术属于L‑亮氨酸生产工艺领域，公开了一种发酵生产L‑亮氨酸的方法，其包括如下步骤：采用产L‑亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1‑1g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为50‑100g/L；当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1‑0.5 ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10‑20%；当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为20‑80mg/L。本发明专利技术方法发酵效率高，操作简单，成本低廉。

A method of L-leucine production by fermentation

The invention belongs to the field of L \u2011 leucine production technology, and discloses a method for producing L \u2011 leucine by fermentation, which includes the following steps: fermentation of L \u2011 leucine by Brevibacterium flavum for more than 44h; when fermentation reaches 30h, add sodium acetate solution into the fermentation tank, control the concentration of sodium acetate in the fermentation solution to be 0.1 \u2011 1g / L until the end of fermentation, and the concentration of the sodium acetate solution The degree is 50 \u2011 100g / L; when the fermentation time is 30h, add malonic acid aqueous solution to the fermentation tank, and control the concentration of malonic acid in the fermentation solution to be 0.1 \u2011 0.5ml/l until the end of fermentation; the concentration of malonic acid aqueous solution is 10 \u2011 20%; when the fermentation time is 40H, add chitosan to the fermentation tank, and control the concentration of chitosan in the fermentation solution to be 20 \u2011 80mg / L. The method has the advantages of high fermentation efficiency, simple operation and low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产L-亮氨酸的方法
本专利技术属于L-亮氨酸生产工艺领域，具体提供一种发酵生产L-亮氨酸的方法。
技术介绍
L-亮氨酸又称白氨酸，化学名为α-氨基异己酸，分子式为C6H13O2N，相对分子量131.18，是一种非极性氨基酸，味微苦，溶于水，等电点5.98，在医药、食品、调味剂、动物饲料及化妆品的制造等许多行业中有着广泛的应用。我国对于L-亮氨酸的研究起步相对较晚，部分企业发酵法生产L-亮氨酸水平较低，而且对下游预处理及提取工艺的研究相对较少，很难实现工业化生产，并且存在酸碱消耗高、污染严重以及现产品收率和纯度低等问题。目前，L-亮氨酸生产方法主要是发酵法，发酵法生产的L-亮氨酸发酵液经过提取、蒸发浓缩、离心烘干等步骤才能制成成品。申请人之前的专利技术“一种生产L-亮氨酸的发酵工艺”，通过在发酵中后期流加复合氨基酸溶液和营养液来提高亮氨酸的产量，但是上述流加液的成本较高，不适合规模化生产。申请人之前的专利技术“一种提高L-亮氨酸发酵产量的方法”，采用膜偶联间歇透析发酵，有效降低了副产物的浓度，提高了糖酸转化率，通过在发酵中期补充含有甘油和甜菜碱的营养液，能够促进发酵液中L-亮氨酸产量和糖酸转化率；但是，该方法存在工序繁琐的缺陷。提供一种成本低廉、操作简易、可持续性发展的亮氨酸发酵工艺是我们需要解决的技术问题。
技术实现思路
为解决L-亮氨酸在工业发酵生产中的共性问题，本专利技术提供了一种发酵生产L-亮氨酸的方法，该方法发酵效率高，操作简单，成本低廉。本专利技术是通过如下技术方案来实现的。一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：采用产L-亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1-1g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为50-100g/L；当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1-0.5ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10-20%；当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为20-80mg/L。优选地，控制在发酵液中醋酸钠的浓度为0.4-0.5g/L。优选地，控制在发酵液中丙二酸的浓度为0.2-0.3ml/L。优选地，控制发酵液中壳聚糖的浓度为40-50mg/L。优选地，所述方法包括如下步骤：按8-10%的接种量将产L-亮氨酸的黄色短杆菌种子液接入装有发酵罐培养基的发酵罐中，搅拌转速300-500r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在20-30%；通过流加氨水控制pH在7.0；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期为44h。优选地，所述发酵罐培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO410g/L，玉米浆10g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO4·H2O10mg/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，VB15mg/L，生物素50μg/L。优选地，所述营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。与现有技术相比，本专利技术取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：乙酸是亮氨酸发酵过程中的主要副产物之一；本专利技术发现，在发酵过程中，添加醋酸钠，可以对乙酸合成途径进行反馈抑制，乙酸合成途径受阻，Val生成量也相应减少，更多的代谢流流向Leu合成途径；丙二酸能够抑制TCA循环的关键酶，进而减弱TCA循环，减少了TCA循环中乙酸等副产物的生成量，更多的碳源进入Leu合成途径，从而提高Leu的产量；发酵中后期，添加一定量的壳聚糖，壳聚糖上的氨基与细菌细胞壁中带负电荷的磷壁酸或脂多糖结合，并螯合Mg2+、Ca2+等阳离子，从而改变细胞壁的通透性，促进亮氨酸分泌到胞外，从而提高亮氨酸产量；但是壳聚糖浓度过大时，会对菌株造成一定的损伤，菌株增殖受阻并且发生死亡。附图说明图1：醋酸钠浓度对L-Leu产量的影响；图2：醋酸钠浓度对Val和Hac含量的影响；图3：丙二酸浓度对L-Leu产量的影响；图4：壳聚糖浓度对L-Leu产量的影响。具体实施例为了使本
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本专利技术进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本专利技术保护的范围。实施例1一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：试验菌株：黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）TK0303（Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr）。常规培养方式获得黄色短杆菌种子液，按10%的接种量将黄色短杆菌种子液接入装有300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，接种浓度OD600为1.5；搅拌转速400r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在25%；通过自动流加氨水控制pH在7.0；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/L，发酵结束前6小时停止流加；发酵周期44h。发酵罐培养基的组分：葡萄糖50g/L，(NH4)2SO410g/L，玉米浆10g/L，KH2PO44g/L，MgSO4·7H2O1.5g/L，柠檬酸0.5g/L，MnSO4·H2O10mg/L，FeSO4·7H2O0.1g/L，VB15mg/L，生物素50μg/L。所述营养液的组分：葡萄糖100g/L，甘油5g/L，甜菜碱1g/L。当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.5g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为100g/L。当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.2ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为15%（v/v）。当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为40mg/L。实施例2一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：试验菌株：黄色短杆菌（Brevibacteriumflavum）TK0303（Met-+IleL+2-TAr+α-ABr+β-HLr+Rifr+SGr）。常规培养方式获得黄色短杆菌种子液，按8%的接种量将黄色短杆菌种子液接入装有300L发酵罐培养基的500L发酵罐中，接种浓度OD600为1.8；搅拌转速350r/min；通过搅拌和通风控制溶氧在25%；通过自动流加氨水控制pH在6.8；培养温度33℃；以泡敌消泡；当发酵至20h时，将营养液流加进罐内，维持发酵罐内糖浓度为1g/本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：采用产L-亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；/n当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1-1g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为50-100g/L；/n当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1-0.5 ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10-20%；/n当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为20-80mg/L，直至发酵结束。/n

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产L-亮氨酸的方法，其包括如下步骤：采用产L-亮氨酸的黄色短杆菌发酵44h以上；
当发酵至30h时，往发酵罐中流加醋酸钠水溶液，控制发酵液中醋酸钠的浓度为0.1-1g/L，直至发酵结束，所述醋酸钠水溶液的浓度为50-100g/L；
当发酵至30h时，往发酵罐中流加丙二酸水溶液，控制发酵液中丙二酸的浓度为0.1-0.5ml/L，直至发酵结束；所述丙二酸水溶液的浓度为10-20%；
当发酵至40h时，往发酵罐中添加壳聚糖，控制发酵液中壳聚糖的浓度为20-80mg/L，直至发酵结束。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制在发酵液中醋酸钠的浓度为0.4-0.5g/L。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制在发酵液中丙二酸的浓度为0.2-0.3ml/L。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，控制发酵液中壳聚糖的浓度为40-50mg/L。

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【专利技术属性】
技术研发人员：冯世红，包鑫，史静东，韦树高，边恩来，
申请(专利权)人：冯世红，
类型：发明
国别省市：新疆;65