光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法技术

光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法，其链接基质物的紫外光脱保护基团使用了‑MENPOC或‑NPPOC；其合成方法通过步骤(1)‑(7)合成出可带有目标碱基序列且可剥离的寡核苷酸。本发明专利技术提出的光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。

Linking matrix and synthesis method for DNA synthesis of photodirected microarray

【技术实现步骤摘要】
光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法
本专利技术涉及DNA合成
，尤其涉及光定向微阵列DNA合成的链接基质物和合成方法。
技术介绍
传统上在微阵列合成方法中，合成的DNA一般是固定在玻璃片表面的。因此通常会有一到六个起始碱基被预附在玻璃表面，这样使合成的DNA更加稳固。然后，另一终端的5'端是被保护基团，光定向DNA合成就从这个5'端延伸出去。问题是，这些起始的碱基干扰了许多实验，因为你不知道你的目标对象是结合到了这些起始的碱基还是你需要的目标碱基。同时，当今的高通量基因组应用，尤其是下一代测序，需要大量的寡核苷酸。许多目标测序应用需要数十万个探针来捕获所需的基因组序列。传统上，这些探针是使用传统的DNA合成仪一次一条地合成出来的。合成速度太慢且非常昂贵，不能满足此应用的需要。微阵列法能大批量的合成DNA但目前尚未使用在这个用途上，因为目前合成的寡聚物DNA与玻璃表面是以共价方式结合的，无法剥离下来。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其利用MENPOC或NPPOC作为光敏基团。本专利技术还提出光定向微阵列DNA合成的方法，其通过步骤(1)-(7)合成出可带有目标碱基序列且可剥离的寡核苷酸。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：光定向微阵列DNA合成的链接基质物，所述链接基质物的结构式如下：其中：-R为紫外光脱保护基团。更进一步说明，所述R为MENPOC或NPPOC；所述链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：所述链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：光定向微阵列DNA合成的方法，包括以下步骤：(1)将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为上述的链接基质物；(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团R1，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；单体的结构式为：B1’为带有目标碱基；R1为保护基团；R2为保护基团；对于加入的第一个单体，只需要照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团R，使目标碱基结合于链接基质物；(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；(4)对获得目标碱基的寡核苷酸氧化，并洗涤；(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；(6)重复上述步骤(2)-(5)；(7)合成完成后，将玻璃载体置于氨水中，在60℃下至少浸泡4小时，使寡核苷酸脱离玻璃载体，获得最终寡核苷酸。更进一步说明，所述R1为保护组基团为MENPOC或NPPOC。更进一步说明，所述步骤1中，将链接基质物附于玻璃载体表面的方法为：按质量份数，将APTS试剂稀释成3-5％的溶液，制得溶液A；利用磷酸盐缓冲液稀释链接基质物，制得溶液B；将溶液A和溶液B混合于玻璃载体，在60℃下反应至少2小时。更进一步说明，所述步骤(2)中，使用360-370nm的二极管照射数字微镜器，该数字微镜器将光线定向到玻璃表面选择的区域，可选择性地照射区域内的阵列点，使被照射阵列点上的寡核苷酸去保护组基团并进行延长合成。更进一步说明，所述Cap试剂包括：无水醋酸和NMI试剂。更进一步说明，所述步骤(4)中，使用碘氧化获得目标碱基的寡核苷酸。更进一步说明，所述碘的量为0.02摩尔。更进一步说明，步骤(7)中获得的最终寡核苷酸置于Tris-EDTA缓冲液中保存。本专利技术的有益效果：本专利技术提出的光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。附图说明图1为实施例3毛细管电泳分析图；图2是实施例4毛细管电泳分析图；图3是MENPOC的氯化物；图4是NPPOC-dA(tac)酰胺；图5是带MENPOC保护基团的链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图；图6是带NPPOC保护基团的链接基质物接入玻璃表面后的分子链变化图。图7是链接基质物附到玻璃载体前，该玻璃载体表面的结构示意图；图8是链接基质物连接于玻璃载体表面的结构示意图；图9是链接基质物去保护基团的结构示意图；图10是第一个带目标碱基的单体连接于链接基质物的示意图；图11是同步剥离和去保护合成的寡核苷酸的示意图。具体实施方式下面结合附图通过具体实施方式来进一步说明本专利技术的技术方案。光定向微阵列DNA合成的链接基质物，所述链接基质物的结构式如下：其中：-R为紫外光脱保护基团。该链接基质物连接到玻璃表面，用于光定向微阵列DNA合成，该链接基物质分子中的硅元素为玻璃上的，玻璃优选为石英玻璃。本链接基质物，其特征结构能直接连接第一个碱基，在合成DNA之前无需使用多余或未使用的碱基，即无需提前连接起始碱基，减少了起始碱基对后续使用的干扰，解决了现有技术中起始碱基与目标碱基不清楚明确的问题。同时，该特征结构，能在合成最终的寡核苷酸后可自玻片载体剥离开，从而使合成的最终寡核苷酸可自玻璃表面释放出，用于其他下游的基因组学应用中。在这里我们采用了这些广泛使用的通用合成链接基质，并将其附着在玻璃表面。此外，我们修改了保护组，以便它们可用于光定向DNA合成。通过这样做，我们解决了使用微阵列合成法进行基因组学应用遇到的两个主要问题。解决的两个关键问题如下：1、免除了使用没有必要的起始碱基；传统上在微阵列合成中，合成的DNA一般是固定在玻璃片表面的。因此通常会有一到六个起始碱基被预附在玻璃表面。这样使合成的DNA更加稳固。然后，另一终端的5'端是被MENPOC或NPPOC组保护。光定向DNA合成就从这个5'端延伸出出去。问题是，这些起始的碱基干扰了许多实验，因为你不知道你的目标对象是结合到了这些起始的碱基还是你需要的目标碱基。使用我们提出的通用链接基质可以解决此问题。我们第一个碱基直接连接到通用链接基质上，序列中的所有碱基都是合成的目标碱基。2、可剥离性；当今的高通量基因组应用，尤其是下一代测序，需要大量的寡核苷酸。许多目标测序应用需要数十万个探针来捕获所需的基因组序列。传统上，这些探针是使用传统的DNA合成仪一次一条地合成出来的。合成速度太慢且非常昂贵，不能满足此应用的需要。微阵列法能大批量的合成DNA但目前尚未使用在这个用途上。因为目前合成的寡聚物DNA与玻璃表面是以共价方式结合的，无法剥离下来。而本专利技术的链接物包含碱基和玻璃表面之间的琥珀酸链接基质。在寡核苷酸脱保护过程中，完成了合成之后，这种链接基质很容易被自玻璃表面切裂剥离下来本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其特征在于，所述链接基质物的结构式如下：/n

【技术特征摘要】
1.光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其特征在于，所述链接基质物的结构式如下：



其中：-R为紫外光脱保护基团。


2.根据权利要求1所述的光定向微阵列DNA合成的链接基质物，其特征在于，所述R为MENPOC或NPPOC；
所述链接基质物为MENPOC链接基质物时，其结构式如下：



所述链接基质物为NPPOC链接基质物时，其结构式如下：





3.光定向微阵列DNA合成的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将链接基质物附到玻璃载体的表面；链接基质物为权利要求2的链接基质物；
(2)使用DNA合成仪，该合成仪使用360-370nm的二极管激光作为光源，照射需要添加目标碱基的寡核苷酸，去除寡核苷酸的保护组基团R1，使带有目标碱基的单体与链接基质物结合；
单体的结构式为：



B1’为带有目标碱基；R1为保护基团；R2为保护基团；
对于加入的第一个单体，只需要照射链接基质物，去除链接基质物的保护组基团R，使目标碱基结合于链接基质物；
(3)洗涤后，使用Cap试剂封闭未反应的寡核苷酸，再洗涤；
(4)对获得目标碱基的寡核苷酸氧化，并洗涤；
(5)使用短Cap，并进行长洗，获得中间寡核苷酸；
(6)重复上述步骤(2)-(5)；
(7)合成完成后，将玻璃载体置于氨水中，在60℃下至少浸泡4小时，使寡...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建中，亚当斯杰，
申请(专利权)人：佛山市艾达思精密仪器有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44