用于多靶标扩增的避免二聚体的多重聚合酶链式反应制造技术

本公开涉及用于扩增核酸的方法，所述方法避免与引物‑二聚体形成相关的问题。本方法在本文中称为避免二聚体的多重聚合酶链式反应(dam‑PCR)。本文公开的所述方法通常包括以下步骤：反转录DNA(例如来自RNA样品的cDNA)的至少一个第一条链，其中DNA的每个第一条链掺入反向共用引物结合位点；选择DNA的每个第一条链；从DNA的至少一个第一条链中的每个中合成DNA的至少一个第二条链，其中DNA的每个第二条链掺入正向共用引物结合位点；选择cDNA的每个第二条链；以及使用共用引物扩增DNA链。或者，所述方法可以使用gDNA模板进行。由于在扩增前DNA链的选择和未使用的引物的去除，本文所述的方法避免引物‑二聚体形成，并与常规的多重PCR方法相比，允许更高的灵敏度和效率。

Dimer free multiplex PCR for multiple target amplification

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于多靶标扩增的避免二聚体的多重聚合酶链式反应相关申请的交叉引用本申请要求在2017年3月9日提交的题为“用于多靶标扩增的避免二聚体的多重聚合酶链式反应”的美国申请No.：62/469,309的优先权，其通过引用并入本文。
技术介绍
聚合酶链反应(PCR)已经使DNA扩增的使用能够用于多种用途，包括分子诊断测试。已经开发了多重PCR方法来扩增样品中的多种核酸以能够检测和鉴定多种靶序列。使用多重PCR，必须选择将特异性结合不同靶序列的多个引物以允许扩增那些序列。然而，多个引物的使用已证明在常规的多重PCR方法学的情况下是有问题的，所述方法学需要优化引物组、温度条件和酶，以满足对于不同引物可能需要的不同条件。因此，需要精心的计划和测试以找到用于常规多重PCR方法的兼容的引物组。与多重PCR相关的挑战由引物-二聚体的形成而加剧，当使用多个引物时经常产生引物-二聚体。引物-二聚体的形成可能产生一些靶序列非常有效地扩增，而其它靶序列非常低效地扩增或根本不能扩增的结果。这种不均匀扩增的可能性也使得精确地进行终点(end-point)定量分析是困难的至不可能的，并且需要大量的引物优化以确定哪些引物可以在特定的多重PCR测定中适当地组合。即使在以下方法中引物-二聚体的问题仍可能存在：在其中在早于使用共用引物进一步扩增的初始PCR循环期间使用基因特异性引物以富集靶序列的方法。尽管如此，目前的范例是引物的选择必须被优化以实现多重PCR的理想执行[例如，Canzar等人，Bioinformatics，2016，1-3(“Canzar”)]。r>因此，仍然需要一种方法，其能够使用多个引物扩增多个靶序列，同时避免引物-二聚体形成的负面影响，而不需要繁重且昂贵的引物优化。专利技术概述在一个实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括以下步骤：使用反向引物混合物从含有至少一种靶序列的mRNA中反转录cDNA的至少一个第一条链，形成第一条链cDNA；其中所述反向引物混合物含有至少一个反向引物，所述反向引物被配置以将反向共用(common)引物结合位点掺入cDNA的每个第一条链中；选择每个第一条链cDNA；使用正向引物混合物从所述cDNA的至少一个第一条链中的每个中合成cDNA的至少一个第二条链，形成至少一个第一条链：第二条链复合物；其中所述正向引物混合物含有至少一个正向引物，每个正向引物被配置以结合特定的cDNA第一条链，并将正向共用引物结合位点掺入cDNA的每个第二条链中；选择cDNA的每个第二条链；选择每个第一条链：第二条链复合物；使用与至少一个反向共用引物结合位点结合的反向共用引物并使用与至少一个正向共用引物结合位点结合的正向共用引物扩增cDNA链；和选择经扩增的cDNA链。在某些实施方案中，所述方法进一步包括使用与至少一个反向共用引物结合位点结合的反向共用引物并使用与至少一个正向共用引物结合位点结合的正向共用引物扩增经扩增的cDNA链的步骤。在所述方法的某些实施方案中，所述反向引物混合物包含至少一个反向引物，其中所述至少一个反向引物包含掺入到每个第一条cDNA链中作为鉴定标志物的另外的核苷酸。在所述方法的某些实施方案中，所述正向引物混合物包含至少一个正向引物，其中所述至少一个正向引物包含掺入到每个第二cDNA链中作为鉴定标志物的另外的核苷酸。在所述方法的某些实施方案中，每个选择包括使用磁珠从引物混合物中分离cDNA链。在所述方法的某些实施方案中，每个选择包括通过柱纯化从引物混合物中分离cDNA链。在所述方法的某些实施方案中，每个选择包括引物混合物的酶切割。在某些实施方案中，所述第一条链cDNA包含第一条链cDNA:RNA复合物。在某些实施方案中，本公开涉及诊断受试者中疾病的存在的方法，所述方法包括：提供来自所述受试者的样品，所述样品怀疑含有疾病因子，其中所述疾病因子的特征在于靶序列；对样品中的核酸进行本段所述的方法；对经扩增的DNA链测序；和检测来自所述疾病因子的靶序列。在某些实施方案中，本公开涉及产生受试者的免疫状态概况的方法，所述方法包括：对来自受试者的白细胞样品的核酸进行本段所述的方法；对经扩增的DNA链测序；并鉴定和定量代表T细胞受体、抗体和MHC重排的一个或更多个DNA序列以生成受试者的免疫状态概况。在某些实施方案中，所述mRNA获自单个细胞。在某些实施方案中，本公开涉及一种方法，其包括以下步骤：使用第一引物混合物从含有至少一个靶序列的基因组DNA合成DNA的至少一个第一条链，形成第一条链：DNA复合物；其中所述第一引物混合物含有至少一个第一引物，每个第一引物被配置以结合特定的靶序列并将第一共用引物结合位点掺入DNA的每个第一条链中；选择每个第一条链：DNA复合物；使用第二引物混合物从DNA的至少一个第一条链中的每个合成DNA的至少一个第二条链，形成第一条链：第二条链复合物；其中所述第二引物混合物含有至少一个第二引物，每个第二引物被配置以结合特定的DNA第一条链，并将第二共用引物结合位点掺入DNA的每个第二条链中；选择每个第一条链：第二条链复合物；使用与至少一个第一共用引物结合位点结合的第一共用引物并使用与至少一个第二共用引物结合位点结合的第二共用引物扩增DNA链；和选择经扩增的DNA链。在某些实施方案中，所述基因组DNA从单个细胞获得。在某些实施方案中，本公开涉及诊断受试者中疾病的存在的方法，所述方法包括：提供来自受试者的样品，所述样品怀疑含有疾病因子，其中所述疾病因子的特征在于靶序列；从样品中分离核酸；对分离的核酸进行本段所述的方法；对经扩增的DNA链测序；并检测来自所述疾病因子的靶序列。在某些实施方案中，本公开涉及产生受试者的免疫状态概况的方法，所述方法包括：对来自受试者的白细胞样品的核酸进行本段所述的方法；对经扩增的DNA链测序；并鉴定和定量代表T细胞受体、抗体和MHC重排的一个或更多个DNA序列以生成受试者的免疫状态概况。在所述方法的某些实施方案中：所述第一引物混合物为反向引物混合物，每个第一引物为反向引物，每个第一共用引物为反向共用引物，且每个第一共用引物结合位点为反向共用引物结合位点；且所述第二引物混合物为正向引物混合物，每个第二引物为正向引物，每个第二共用引物为正向共用引物，且每个第二共用引物结合位点为正向共用引物结合位点。在所述方法的某些实施方案中：所述第一引物混合物为正向引物混合物，每个第一引物为正向引物，每个第一共用引物为正向共用引物，且每个第一共用引物结合位点为正向共用引物结合位点；且所述第二引物混合物为反向引物混合物，每个第二引物为反向引物，每个第二共用引物为反向共用引物，且每个第二共用引物结合位点为反向共用引物结合位点。在所述方法的某些实施方案中：所述第一引物混合物为包含至少一个正向引物和至少一个反向引物的引物混合物，每个第一引物为正向或反向引物，每个第一共用引物为正向或反向共用引物，且每个第一共用引物结合位点为正向或反向共用引物结合位点；且所述第二引物混合物包含至少一个正向引物和至少一个反向引物，其中第一引物混合物中不包括第二引物混合物中的正向或反向引物，每个第二共用引物为正向或反向共用引物，且每个第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种方法，其包括以下步骤：/n使用反向引物混合物从含有至少一种靶序列的mRNA中反转录cDNA的至少一个第一条链，形成至少一个第一条链cDNA；/n其中所述反向引物混合物含有至少一个反向引物，所述反向引物被配置以将反向共用引物结合位点掺入cDNA的每个第一条链中；/n选择每个第一条链cDNA；/n使用正向引物混合物从所述cDNA的至少一个第一条链中的每个中合成cDNA的至少一个第二条链，形成至少一个第一条链：第二条链复合物；/n其中所述正向引物混合物含有至少一个正向引物，每个正向引物被配置以结合特定的cDNA第一条链，并将正向共用引物结合位点掺入cDNA的每个第二条链中；/n选择每个第一条链：第二条链复合物；/n使用与至少一个反向共用引物结合位点结合的反向共用引物并使用与至少一个正向共用引物结合位点结合的正向共用引物扩增cDNA链；和/n选择经扩增的cDNA链。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170309 US 62/469,3091.一种方法，其包括以下步骤：
使用反向引物混合物从含有至少一种靶序列的mRNA中反转录cDNA的至少一个第一条链，形成至少一个第一条链cDNA；
其中所述反向引物混合物含有至少一个反向引物，所述反向引物被配置以将反向共用引物结合位点掺入cDNA的每个第一条链中；
选择每个第一条链cDNA；
使用正向引物混合物从所述cDNA的至少一个第一条链中的每个中合成cDNA的至少一个第二条链，形成至少一个第一条链：第二条链复合物；
其中所述正向引物混合物含有至少一个正向引物，每个正向引物被配置以结合特定的cDNA第一条链，并将正向共用引物结合位点掺入cDNA的每个第二条链中；
选择每个第一条链：第二条链复合物；
使用与至少一个反向共用引物结合位点结合的反向共用引物并使用与至少一个正向共用引物结合位点结合的正向共用引物扩增cDNA链；和
选择经扩增的cDNA链。


2.权利要求1所述的方法，其进一步包括使用与所述至少一个反向共用引物结合位点结合的反向共用引物并使用与所述至少一个正向共用引物结合位点结合的正向共用引物扩增经扩增的cDNA链的步骤。


3.权利要求1所述的方法，其中所述反向引物混合物包含至少一个反向引物，其中所述至少一个反向引物包含掺入到每个第一条cDNA链中作为鉴定标志物的另外的核苷酸。


4.权利要求1所述的方法，其中所述正向引物混合物包含至少一个正向引物，其中所述至少一个正向引物包含掺入到每个第二cDNA链中作为鉴定标志物的另外的核苷酸。


5.权利要求1所述的方法，其中每个选择包括使用磁珠从引物混合物中分离cDNA链。


6.权利要求1所述的方法，其中每个选择包括通过柱纯化从引物混合物中分离cDNA链。


7.权利要求1所述的方法，其中每个选择包括引物混合物的酶切割。


8.权利要求1所述的方法，其中所述第一条链cDNA包含第一条链cDNA:RNA复合物。


9.一种诊断受试者中疾病的存在的方法，所述方法包括：
提供来自所述受试者的样品，所述样品怀疑含有疾病因子，其中所述疾病因子的特征在于靶序列；
对所述样品中的核酸进行权利要求1所述的方法；
对经扩增的DNA链测序；和
检测来自所述疾病因子的靶序列。


10.一种产生受试者的免疫状态概况的方法，所述方法包括：
对来自所述受试者的白细胞样品的核酸进行权利要求1所述的方法；
对经扩增的DNA链测序；和
鉴定和定量代表T细胞受体、抗体和MHC重排的一个或更多个DNA序列以生成所述受试者的免疫状态概况。


11.权利要求1所述的方法，其中所述mRNA获自单个细胞。


12.一种方法，其包括以下步骤：
使用第一引物混合物从含有至少一个靶序列的基因组DNA合成DNA的至少一个第一条链，形成第一条链：DNA复合物；
其中所述第一引物混合物含有至少一个第一引物，每个第一引物被配置以结合特定的靶序列并将第一共用引物结合位点掺入DNA的每个第一条链中；
选择每个第一条链：DNA复合物；
使用第二引物混合物从DNA的至少一个第一条链中的每个合成DNA的至少一个第二条链，形成第一条链：第二条链复合物；
其中所述第二引物混合物含有至少一个第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘文京，米兰达·伯恩斯蒂尔，侯晓红，布里塔尼·布朗，韩建，
申请(专利权)人：艾瑞普特公司，
类型：发明
国别省市：美国;US