一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用技术

本发明专利技术属于病原体检测技术领域，尤其涉及一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。本发明专利技术针对加林疏螺旋体特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时采用人内源性β球蛋白管家基因作为内参基因，采用β球蛋白特异性引物和探针检测标本中内参基因DNA，利用实时荧光定量PCR技术能够更快速、准确且灵敏地检测出加林疏螺旋体，特异性强、灵敏度高，在进行病原体定性分析的同时还能进行病原体定量分析，定量线性范围好；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。

A real-time fluorescent quantitative PCR detection primer and probe, detection kit, detection method and its application

The invention belongs to the technical field of pathogen detection, in particular to a real-time fluorescent quantitative PCR detection primer and probe, a detection kit, a detection method and an application thereof. The invention designs a pair of specific primers and a specific fluorescent probe for the same or similar segment of the conserved gene sequence of the specific helix carinosporus. At the same time, the human endogenous \u03b2 globulin housekeeping gene is used as the internal reference gene, the \u03b2 globulin specific primers and probes are used to detect the internal reference gene DNA in the specimen, and the real-time fluorescent quantitative PCR technology can be faster and more accurate It can accurately and sensitively detect helix carinosporus, with strong specificity and high sensitivity. It can also conduct quantitative analysis of pathogens while conducting qualitative analysis of pathogens, with good quantitative linear range; simple operation and easy promotion; good repeatability and high precision of experimental results; it can monitor the whole process of sample extraction and amplification through the detection results of internal reference genes.

【技术实现步骤摘要】
一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用
本专利技术属于病原体检测
，尤其涉及一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用。
技术介绍
加林疏螺旋体(Borreliaegarinii)属于螺旋体科、疏螺旋体菌属。加林疏螺旋体是一种人畜共患的病原体，它能通过蓖麻子硬蜱和全沟硬蜱等节肢动物叮咬后，在啮齿类动物和人之间传播。加林疏螺旋体感染人后可导致发热、寒战、肌肉疼痛、关节炎、皮肤出现皮疹，严重的可导致中枢神经系统疾病，包括剧烈头痛、脑神经麻痹、轻度截瘫和四肢瘫痪等。但是，目前针对加林疏螺旋体的现有检测方法如细菌培养、血清中和、ELISA及免疫荧光等，均存在操作繁琐、周期长，特异性差等弊端，急切需要开发一种新的能够快速且准确对病原体进行鉴定的方法。市面上已有一种针对加林疏密螺旋体的试剂盒，但此试剂盒采用的是荧光染料方法，此方法有个非常大的缺陷，就是容易产生非特异性的扩增，特异性查。目前所有在临床使用的病原体检测试剂盒，均不是采用荧光染料法，这也说明荧光染料法不适用于病原体检测。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括加林疏螺旋体特异性引物及探针序列，见SEQIDNO.1-3；内标基因β球蛋白特异性引物及探针序列，见SEQIDNO.4-6。如上述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针在制备用于检测加林疏螺旋体的试剂盒中的应用。一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。进一步地，还包括：阳性对照品：加林疏螺旋体标准品；内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；阴性对照品：RNaseFreeH2O。一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，包括：以样品DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针。进一步地，所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针、5×PCRBuffer和EnzymeMix；扩增程序为：95℃5min；95℃15sec、57℃45sec，45个循环。进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：当FAM荧光通道中Ct≤40时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，判断样品为加林疏螺旋体阳性；当FAM荧光通道中40<Ct≤45时，HEX荧光通道有或无扩增曲线时，重复一次实验，如果FAM荧光通道Ct还是在此范围之内或小于等于40就判断样品为加林疏螺旋体阳性，否则判断样品为加林疏螺旋体阴性；当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX荧光通道中Ct≤45时，判断样品为加林疏螺旋体阴性；当FAM荧光通道中无扩增曲线时，且HEX通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需重新提取标本DNA和重新扩增检测。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：1、本专利技术提供了加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，更够快速、准确且灵敏地检测出加林疏螺旋体；特异性强，对其他螺旋体和常见病毒、细菌和真菌都没有非特异性扩增；灵敏度高，高达5拷贝/ml。2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一个探针就检测出加林疏螺旋体，且使其特异性强，灵敏度高的问题，这也是本申请最大的技术难点。本专利技术采用单管双荧光通道同时检测加林疏螺旋体和内参基因β球蛋白的存在，能检测脑脊液、咽拭子等标本中加林疏螺旋体DNA的存在。当脑脊液、全血、血浆或鼻咽拭子中的存在PCR抑制时，容易造成病原体核酸定量结果不准备甚至出现“假阴性”，针对这个难点与技术问题，本专利技术设计了内参基因，可对标本提取和扩增这整个过程进行质量监控，能监控DNA是否成功提取以及后续的逆转录和PCR是否顺利进行，以及监控是否出现人工操作失误。3、本专利技术提供了加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，将检测时间缩短到了1小时内，而一般检测方法的时间是2～4小时；本专利技术采用了UNG酶，UNG酶能显著的降解前一次扩增的PCR产物，能极大程度的减少污染发生的概率，同时由于样本提取和扩增时间缩短，减少了暴露在潜在污染源的可能性，进一步减少了污染的发生概率；本专利技术所涉及的材料和试剂价格低廉，容易获取，UNG酶、taq酶和引物和探针的价格明显低于免疫法的单克隆抗体，使得本专利技术的样品诊断成本低，具有潜在的应用价值。本专利技术检测时间周期短、检测效率高；本发生所涉及的引物和探针序列均只特异性的靶向加林疏螺旋体，探针序列长达33bp，使得与其他生物产生非特异性扩增的概率为(1/4)33，几乎为零，这也保证了本专利技术的特异性和准确率高；在进行病原体定性分析的同时还能进行病原体定量分析，定量线性范围好；检测灵敏度高；操作简单、易于推广；实验结果重复性好，精密度高；能通过内参基因的检测结果对样本的提取和扩增整个过程进行质量监控。附图说明图1是加林疏螺旋体标准品扩增曲线；图2是加林疏螺旋体标准品浓度标准曲线；图3是20例血清标本加林疏螺旋体荧光定量PCR扩增曲线；图4是20例血清标本内参基因β球蛋白扩增曲线；图5是本专利技术试剂盒检测线性范围分析；图6是19例皮肤活检标本加林疏螺旋体荧光定量PCR扩增曲线；图7是19例皮肤活检标本内参基因β球蛋白扩增曲线。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术披露了一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针、检测试剂盒、检验方法及其应用，具体如下各实施例所示。实施例1试剂盒的开发本专利技术在对加林疏螺旋体核酸序列分析的基础上，选取加林疏螺旋体特异性的保守基因序列的相同或相似区段设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，同时，选取β球蛋白做内标基因，设计特异性引物和荧光探针，利用实时荧光定量PCR技术可对加林疏螺旋体进行检测。引物及探针序列见表1。表1试剂盒中还包括阳性对照：加林疏螺旋体标准品；阴性对照：RNaseFreeH2O；内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；5×PCRBuffer和EnzymeMix。其中5×PCRBuffer和EnzymeMix的配制如下：5×PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括加林疏螺旋体特异性引物及探针序列，见SEQ ID NO.1-3；内标基因β球蛋白特异性引物及探针序列，见SEQ IDNO.4-6。/n

【技术特征摘要】
1.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测引物和探针，包括加林疏螺旋体特异性引物及探针序列，见SEQIDNO.1-3；内标基因β球蛋白特异性引物及探针序列，见SEQIDNO.4-6。


2.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括如权利要求1所述的实时荧光定量PCR检测引物和探针。


3.根据权利要求2所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：
阳性对照品：加林疏螺旋体标准品；
内标溶液：含β球蛋白序列的质粒溶液；
阴性对照品：RNaseFreeH2O。


4.一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：以样品DNA为模板，配制扩增反应体系进行实时荧光PCR扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括权利要求1所述的加林疏螺旋体的实时荧光PCR检测引物对和探针。


5.根据权利要求4所述的一种加林疏螺旋体实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系包括：样品模板、权利要求1所述的加林疏螺旋体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘为勇，吴建国，刘映乐，谭秋萍，
申请(专利权)人：广东龙帆生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44