一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及检测技术领域，具体而言，涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。该检测试剂盒包含正反向引物及探针、侧流层析试纸条；所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用Fluorescein Isothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3‑spacer进行末端封闭。本发明专利技术使用RPA‑LFS(The isothermal recombinase polymerase amplification and the lateral flow strip)方法能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高。

A forward and reverse primer, probe, detection kit and its application for Listeria monocytogenes

【技术实现步骤摘要】
一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及检测
，尤其涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。
技术介绍
单核细胞增生性李斯特菌(L.monocytogenes)简称单增李斯特菌，是革兰氏阳性菌。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多，其致死率高达44％。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌可广泛存在于多种食品中,如水产品、肉制品、奶制品、蔬菜等,在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，且能引起各种食物间的交叉感染，被称为“冰箱杀手”。本研究主要通过不同浓度的灭活菌液污染当地购买新鲜牛奶，制备待检测模板以达到鉴别单增李斯特菌和其它易感染致病菌目的，如金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肠致病性埃希氏菌(E.coliO157)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、沙门氏菌(S.enteritidis)等。现有的通常对于食源性单增李斯特菌的检测是通过培养法，需要实验室操作并且周期较长，检测较为繁琐；利用分子手段进行检测，通常需要昂贵的仪器设备及具备专业技能的实验人员，成本较高；近年由于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA技术)、侧流层析试纸条检测技术(LFS)的兴起，本专利技术通过RPA-LFS技术快速鉴别单增李斯特菌，以期为该菌检测带来新的技术参考。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针、检测试剂盒及其应用。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：本专利技术涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。本专利技术还涉及一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用FluoresceinIsothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。优选地，所述正反向引物长度为30bp。优选地，所述探针长度45bp。优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。本专利技术的有益效果：本专利技术使用RPA结合胶体金试纸条快速检测食源性单增李斯特菌，能够在不依赖仪器设备的非实验室环境下，实现实时、实地、即时的快速现场检测，且准确率高，耗时短。附图说明图1为试纸条组装示意图；图2为本专利技术实施例中探针种间特异性筛选结果；图3为本专利技术实施例中RPA-LFS最低检出限测定结果。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。本专利技术涉及一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。本专利技术还涉及一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其包含上述所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:所述反向引物5'端用生物素进行标记；所述探针5'端用FluoresceinIsothiocyanate(FITC)标记，中间区域C碱基(距5'端至少30bp、距3'端至少15bp)用[THF]进行替换，3'端用C3-spacer进行末端封闭。优选地，所述正反向引物长度为30bp。优选地，所述探针长度45bp。优选地，所述检测试剂盒还包括胶回收试剂、核酸提取试剂、核酸纯化试剂、RPA扩增试剂中一种或多种。优选地，所述RPA扩增试剂为重组酶聚合酶等温扩增试剂。实施例试验材料单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色萄球菌、肠致病性埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌标准株基因组均由武汉市食品化妆品检疫所提供；Basickit、nfokit购自英国TwistDX公司；侧流层析试纸条购自杭州优思达生物技术有限公司；PCR清洁试剂盒购自莫纳生物科技有限公司；Qubit4购自ThermoScientific；MonAmpTMSYBRGreen购自莫纳生物科技有限公司；本研究所用引物和探针均由通用生物系统(安徽)有限公司合成；罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪，购自罗氏制药。试验方法引物及探针设计从NCBI上获取单增李斯特菌基因组序列，用Primer-Blast通过不同参数设计得到理论上可行的特异性引物。RPA反应筛选引物引物筛选所使用的Basickit反应体系：LM-F(10μM)2.1μL、LM-R(10μM)2.1μL、2XReactionBuffer25μL、10XBasicE-mix5μL、dNTP(1.8mM)2.25μL、Template1μL、ddH2O6.95μL、20XcoreReactionmix2.5μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；通过琼脂糖凝胶电泳及紫外凝胶成像仪检验引物敏感性。RPA-LFS筛选探针用Geneious软件在正反向引物间设计特异性探针，用Primer5.0验证引物探针特性，应在理论上尽量避免正方向引物二聚体、发夹结构、错配、探针和反向引物的二聚体等发生。探针筛选使用nfokit，其反应体系：LM-F(10μM)2.1μL、LM-R(10μM)2.1μL、LM-P(10μM)0.6μL、RehydrationBuffer29.5μL、ddH2O11.2μL、加入冻干粉，混匀、Template2μL、MgOAc(280mM)2.5μL共50μL反应体系；反应温度：37℃；反应时间：30min；反应结束即刻加入EDTA或置于冰上终止反应，再通过侧流层析试纸条检测获得最佳探针正反向引物，并用琼脂糖凝胶电泳进行结果验证。试纸条检测原理本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为/nCTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、/nBiotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为/nFITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。/n

【技术特征摘要】
1.一种单增李斯特菌特异性正反向引物及探针，其特征在于，其正向引物和反向引物分别为LM-F、LM-R，且序列分别为
CTCGCTCTAGGTATCTTTGGGATTTACTAC、
Biotin-GTCCGAATATCATTTACCTCATCAAAAGGG，其探针为LM-P，且序列为
FITC-GTTTCATTCCTGCGTTACTATTCATTGTTG[THF]TGCTATACTTTGTTT-/C3-spacer/。


2.一种单增李斯特菌特异性的检测试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的正反向引物及探针、侧流层析试纸条:
所述反向引物5'端用生物素进行标记；
所述探针5'端用Fluore...

【专利技术属性】
技术研发人员：许恒皓，郦娟，董井泉，王蕾，吉敬，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，连云港海恒生化科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32