用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术实施例公开了用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，其包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术还公开一种包含上述PCR引物和探针的多重荧光定量PCR检测试剂盒。本发明专利技术实施例提供的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其是按照经过多次实验和设计出的特定序列合成引物和探针，经过实验优化的特定引物和探针可以保证扩增的时候能保证较好的特异性和减少同一个反应体系内的引物探针的相互之间的干扰。

Multiplex fluorescent quantitative PCR primers, kits and detection methods for the detection of various bacteria

【技术实现步骤摘要】
用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法
本专利技术实施例涉及微生物检测
，具体涉及一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法。
技术介绍
人体肠道微生物与人的健康有着密切的关系，有些重要种类的细菌所占比例对于人体的健康有重要的影响。通过检测肠道微生物中一些重要的菌种的含量和所占比例，对于判断受检者的某些健康状况和辅助治疗有着一定的意义。目前针对细菌数量和种类的常见的检测方法有：1、传统的选择性培养基培养：该方法主要是通过特定的培养基对样本中特定细菌进行培养，通过菌落的数量来反应样本中该种细菌的数量。该方法是经典、常用的方法，检测结果较为准确。该方法的缺点是：培养的周期长，一般需要数天；检测通量低，有很多对培养条件要求严格的细菌很难培养，鉴定的精度一般，多数情况下无法准确的区分亚种或者突变株。无法发现未知的菌种，多数情况无法在同一个培养基中同时检测多种菌。2、生化鉴定：利用待检菌种产生的特异化学物质，通过特异性的化学反应来检测样本中的对应菌种有无。检测时间相对培养基培养的方法短一些，通量有所提高。但是同样存在检测的精度有限，无法区分亚种或者突变株。另外有很多菌无法产生特异的化学物质，无法采用本方法检测；多数情况无法通过同一个反应检测多种菌。3、荧光定量PCR：根据相应菌种的特异DNA序列设计探针和引物，通过对该菌的DNA进行检测来确认该菌种的有无或者含量。本检测方法检测时间短，检测灵敏度高，DNA提取和扩增只需几小时；检测精度高，可以精确到亚种或者突变株；而且可以通过一个反应检测多种菌。缺点是需要知道待检测菌的特异DNA序列，无法检测未知序列的菌或突变的菌株，如果菌的DNA在引物或者探针处发生了SNP突变会影响检测和定量的准确性。4、NGS二代测序：利用宏基因组或者16S方式对样本提取的DNA进行建库，通过二代测序和生物信息学分析获得各种菌的种类和比例。优点是检测通量高，检测灵敏度高，检测结果准确，宏基因组的方式能够检测到一些未知的菌。缺点是检测周期相对较长，检测成本较高。目前有不少领域需要对样本中的少数几种特定的已知菌进行检测。需要在短时间内检测出样本中是否含有这些菌，以及这些菌在样本中的各自含量。这些检测多数都对检测周期和检测精度要求比较高，从样本开始检测到得出检测结果的时间一般要求一天之内甚至更短，菌也需要精确到种或者亚种水平。因此，荧光定量PCR成为一种常见的检测手段，能在数小时之内得到检测结果，并且可以精确地得到样本中的菌在种，亚种水平的数量。当前用的较广的荧光定量法检测一般是一管反应体系里面检测一种菌。不仅检测通量相对较低，而且检测成本也比较高。如果使用多重PCR扩增和检测技术，可以在一管反应里检测多种菌，能够极大的提高检测通量和降低了检测成本。但是多重PCR的难度比普通PCR高很多，其存在以下缺陷：1、引物和探针的特异性：由于有些同一属内的菌的DNA序列同源性较高，如果引物和探针的特异性不高，会造成非特异性的扩增，将DNA序列相近的菌的序列进行扩增，造成假阳性，影响检测的准确性和导致检测的目的菌的数量升高。2、引物探针的相互干扰：对于荧光定量PCR在一个反应体系内检测多个菌来说，由于在同一个反应体系内存在着多个引物和探针，互相之间容易产生干扰，造成检测结果的不准确，所以合适的引物和探针显得尤为重要。3、引物的扩增效率：如果引物的扩增效率相差较多，那么在同一个反应体系中同时进行扩增时，各引物间会由于扩增效率不同，导致样本初始的DNA扩增的不均衡，一些含量低的菌或者引物扩增效率低的菌无法同含量高或者扩增效率高的引物竞争，导致此类菌的扩增产物较少，荧光信号较弱，造成假阴性结果，影响定量的准确性。
技术实现思路
为此，本专利技术实施例提供一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物、试剂盒及检测方法，以解决现有技术中由于检测的特异性差，对多个菌种的检测效率低的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；所述长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:3所示，所述动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:4所示，所述短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:5所示；所述鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示，所述鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:8所示；所述罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示，所述罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:11所示；所述阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示，所述阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:14所示；所述嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示，所述嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:17所示；所述植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示，所述植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:20所示。本专利技术实施例另一方面还提供一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂和包括上述所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针。本专利技术实施例的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其还包括含有Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP、以及PCR扩增酶。优选的，所述检测试剂盒用于同时检测长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌。优选的，所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。本专利技术实施例另一方面还提供一种检测多种菌的多重荧光定量PCR的方法，其包括利用长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA作为模板，以及上述所述的PCR引物和探针进行多重荧光定量PCR的过程。优选的，所述PCR引物和探针分成第一组分、第二组分以及第三组分；其中，所述第一组分包括所述长双歧杆菌、短双歧杆菌和动物双歧杆菌的引物和探针；所述第二组分包括所述鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的引物和探针；所述第三组分包括阿克曼氏菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的引物和探针。优选的，所述多重荧光定量PCR反应过程包括去污染50℃3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；/n所述长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:3所示，所述动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:4所示，所述短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:5所示；/n所述鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，所述鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:8所示；/n所述罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示，所述罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:11所示；/n所述阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示，所述阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:14所示；/n所述嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示，所述嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:17所示；/n所述植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19所示，所述植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQ ID NO:20所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针，其特征在于包括针对长双歧杆菌、短双歧杆菌、动物双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和阿克曼氏菌的16SrDNA设计引物对及探针，其中，所述长双歧杆菌、动物双歧杆菌和短双歧杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；
所述长双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:3所示，所述动物双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:4所示，所述短双歧杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:5所示；
所述鼠李糖乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:6和SEQIDNO:7所示，所述鼠李糖乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:8所示；
所述罗伊氏乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示，所述罗伊氏乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:11所示；
所述阿克曼氏菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:12和SEQIDNO:13所示，所述阿克曼氏菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:14所示；
所述嗜酸乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:15和SEQIDNO:16所示，所述嗜酸乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:17所示；
所述植物乳杆菌的引物对的核苷酸序列如SEQIDNO:18和SEQIDNO:19所示，所述植物乳杆菌核苷酸探针序列如SEQIDNO:20所示。


2.一种用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，
所述PCR检测试剂和包括权利要求1所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR引物和探针。


3.如权利要求2所述的用于检测多种菌的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于还包括含有Mg2+的PCR反应缓冲液、dNTP、以及PCR...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏广亮，
申请(专利权)人：知几未来成都临床医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51