一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒，属于病原检测技术领域。本发明专利技术用于鸭支原体检测的引物组包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物；本发明专利技术用于鸭支原体检测的试剂盒包括本发明专利技术所述引物组。本发明专利技术提供了针对鸭支原体的特异性引物，采用该特异性引物能特异性地检测出鸭支原体；通过本发明专利技术的试剂盒能采用PCR扩增检测鸭支原体，由此，本发明专利技术提供了快速、特异性检测鸭支原体的方法，为临床控制鸭支原体感染提供有力的技术手段；采用本发明专利技术试剂盒检测总时长在2.5h左右，易于操作，方便快捷，能达到快速检测的目的。

A primer set and kit for detection of duck Mycoplasma

【技术实现步骤摘要】
一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒
本专利技术涉及一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒，属于病原检测

技术介绍
鸭支原体(Mycoplasmaanatis，MA)又叫霉形体，引起慢性呼吸道疾病，简称“慢呼”，主要侵害呼吸道，特征为发展较慢，病程长，不同日龄鸭均可感染，1-2周龄最易感；本病在鸭群中长期蔓延，尤其是在气候多变的春季，主要通过呼吸道、消化道和种蛋传播；发病率较高，发生本病后，鸭体抵抗力降低，极易并发大肠杆菌病，如并发大肠杆菌病可造成大批鸭只死亡，给养鸭业造成较大的经济损失。支原体的检测方法主要包括病原分离培养、血清学方法以及分子生物学方法。分子生物学方法为应用较为普遍的检测方法，但目前尚未有鉴别诊断鸭支原体的PCR检测方法。现有支原体的检测方法用于临床检测周期长、成本高，无法快速诊断出鸭支原体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒，采用该引物组及试剂盒检测鸭支原体不仅快速，而且灵敏度高、特异性好。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：第一方面，本专利技术提供了一种用于鸭支原体检测的引物组，其包括如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。鸭支原体(MA)引起鸭的慢性呼吸道疾病，以眶下窦发炎为主要特征，影响小鸭、成年鸭生长，造成饲料报酬率低，产蛋量显著减少，给养鸭户造成严重经济损失。本专利技术选择鸭支原体1340模式株(NR_025176.1)的16srRNA为靶标基因，通过基因序列的比对分析，选取靶基因序列的特异性区域设计合成了SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。本专利技术引物组扩增条带大小为550bp。针对16srRNA靶标基因特异性区域设计引物时，可设计出长度、起点和终点各不相同的无数种引物。专利技术人研究了各引物的可用性，不断调整引物设计参数，经过大量筛选，最终挑选出本专利技术所述引物。本专利技术引物发夹结构少、错配率低，扩增特异性好。采用本专利技术引物检测鸭支原体特异性好。第二方面，本专利技术提供了上述引物组在制备用于鸭支原体检测的试剂盒中的应用。第三方面，本专利技术提供了一种用于鸭支原体检测的试剂盒，其包括上述引物组。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括PCR预混液和水。本专利技术提供的用于鸭支原体检测的试剂盒为PCR检测试剂盒，采用本专利技术试剂盒检测鸭支原体灵敏度高、特异性好、稳定性高、结果直观、易于操作、方便快捷、能大幅缩短检测时间，为临床控制鸭支原体感染提供有力的技术手段。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTPS、MgCl2和PCR缓冲液。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括DNA提取试剂。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述DNA提取试剂为PBS缓冲液。采用PBS缓冲液可提取鸭的肺脏、卵巢以及精液中支原体。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述阴性对照品为双蒸水，所述阳性对照品包括鸭支原体基因组。作为本专利技术所述用于鸭支原体检测的试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒用于检测的样品为鸭的组织病料样品、鼻咽喉拭子样品或精液。优选地，所述试剂盒用于检测的样品为鸭的肺脏、卵巢或精液。本专利技术试剂盒的使用方法为：(1)采用DNA提取试剂提取待检样品中的DNA；(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，将其与本专利技术引物组和PCR预混液混合，配制PCR反应液，进行PCR扩增；(3)通过琼脂糖凝胶电泳分别对步骤(2)PCR扩增的产物，阴性对照品扩增产物以及阳性对照品扩增产物进行电泳检测，并进行判断。上述步骤(3)判断待检样品中是否存在鸭支原体的标准为：阴性对照品无扩增条带，阳性对照品扩增条带大小为550bp，说明对照成立；待检样品PCR扩增产物中出现550bp条带，即为鸭支原体感染；待检样品PCR扩增产物无条带，即为阴性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了针对鸭支原体的特异性引物，采用该特异性引物能特异性地检测出鸭支原体，其扩增条带大小为550bp。(2)通过本专利技术的试剂盒能采用PCR扩增检测鸭支原体，由此，本专利技术提供了快速、特异性检测鸭支原体的方法，为临床控制鸭支原体感染提供有力的技术手段。采用本专利技术试剂盒检测总时长在2.5h左右，易于操作，方便快捷，能达到快速检测的目的。本专利技术适用于鸭场快速检测，亦适用于流行病学调查。(3)本专利技术的检测极限为1pg/μL，表明本专利技术的鸭支原体PCR检测方法有很高的灵敏度，本专利技术的检测方法既能缩短检测时间，又能降低使用成本。附图说明图1为本专利技术鸭支原体PCR检测方法特异性试验电泳图；图2为本专利技术鸭支原体PCR检测方法灵敏度试验电泳图；图3为本专利技术鸭支原体PCR检测方法对部分临床样品电泳检测结果。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本专利技术用于鸭支原体检测的引物组的一种实施例，本实施例所述用于鸭支原体检测的引物组包括上游引物MA-F和下游引物MA-R。上游引物MA-F的碱基序列如SEQIDNO:1所示，下游引物MA-R的碱基序列如SEQIDNO:2所示。具体见下表1。表1本实施例所述用于鸭支原体检测的试剂盒包括2×TapPCRMix(PCRMix包括DNA聚合酶、dNTPS、MgCl2和PCR缓冲液)、灭菌双蒸水(用于补充PCR反应体系的余量)、本实施例所述MA上游引物和MA下游引物，阴性对照品、阳性对照品，所述阴性对照品为灭菌双蒸水，阳性对照品为鸭支原体基因组。本实施例的试剂盒还可进一步包括DNA提取试剂，优选地，所述DNA提取试剂为PBS缓冲液。实施例2(1)设计PCR引物选择鸭支原体1340模式株(NR_025176.1)的16srRNA为靶标基因，将靶标基因进行BLAST比对分析，选取靶基因序列的差异性区域设计合成了一对鸭支原体特异性扩增引物，在引物设计过程中要注意差异性位点尽量位于引物3'端，同时调整引物参数减少发夹结构、降低错配率，保证扩增特异性。然后对上述引物进行PCR验证，确定引物的可用性，包括特异性和敏感性评估。鸭支原体引物信息如表1所示。上述引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。(2)特异性验证鸭支原体5株(Y1、Y2、Y07-F5、16-F3、F3-F6)......、鸡毒支原体弱毒疫苗株F株、鸡毒支原体强毒株S6株以及HS株、沙门氏菌(CVCC542)、大肠杆菌(ATCC25922)均由华中农业大学微生物与免疫学实验室提供,滑液囊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鸭支原体检测的引物组，其特征在于，包括如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鸭支原体检测的引物组，其特征在于，包括如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物。


2.如权利要求1所述引物组在制备用于鸭支原体检测的试剂盒中的应用。


3.一种用于鸭支原体检测的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述引物组。


4.如权利要求3所述的用于鸭支原体检测的试剂盒，其特征在于，还包括PCR预混液和水。


5.如权利要求4所述的用于鸭支原体检测的试剂盒，其特征在于，所述PCR预混液包括DNA聚合酶、dNTPS、MgCl2和PCR缓冲液。


6.如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋洋，刘军发，杨德鸿，麦凯杰，周祺，罗翠芬，周庆丰，
申请(专利权)人：温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44