一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法技术

本发明专利技术公开了一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法，涉及植物病原菌分离及鉴定技术领域。本方法是：①病原菌的分离；②病原菌的培养；③病原菌的菌落PCR检测：A、模板DNA的制备；B、引物序列：SEQ NO.1和SEQ NO.2；C、菌落PCR扩增体系；D、PCR扩增反应程序；E、取PCR扩增产物5μL，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。本发明专利技术实现了中国猕猴桃花粉样本的溃疡病感病情况快速鉴定，具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点，且检测结果准确、客观；适用于快速准确检测猕猴桃花粉是否携带溃疡病菌，将有效降低我国猕猴桃溃疡病感病花粉的传播率，推动猕猴桃科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。

A rapid detection method of kiwifruit pollen canker

【技术实现步骤摘要】
一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法
本专利技术涉及植物病原菌分离
，尤其涉及一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法。
技术介绍
猕猴桃(ActinidiaLindl.)是20世纪由野生到商业栽培最成功的植物驯化范例，因其富含多种维生素和矿质元素，被誉为“水果之王”。中国是猕猴桃属植物的原产地和猕猴桃栽培品种的发源地，至2018年，中国猕猴桃栽培面积已超越意大利、新西兰及智利等各国种植面积总和，年产量占全球总产量的57％，成为世界最大的猕猴桃生产国。自2008年以来，丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的猕猴桃细菌性溃疡病在世界范围内大面积爆发，已严重危害了世界猕猴桃产业的健康发展。猕猴桃为功能性雌雄异株，雌雄株之间必须通过昆虫授粉或人工授粉才能座果。花粉特性对猕猴桃座果率、果实大小、果肉颜色、果实品质及商品性、产量等起到决定性作用。近年来，带菌花粉已被证实为猕猴桃溃疡病大范围远距离传播的重要途径之一，新西兰、意大利、智利及阿根廷均在猕猴桃花粉中检测到溃疡病菌。2018年，意大利博洛尼亚大学的Donati等人通过荧光及共聚焦显微镜观察到，Psa病原菌可附生或内生定殖在雄花花药上并呈点状分布，在花粉囊裂口处也可观察到带菌花粉，由此证实花粉是Psa远距离传播的重要途径(HorticultureReasearch,2018,5:56)。近几年，申请人通过对中国猕猴桃花粉进行全面调查及鉴定发现，国内大多数猕猴桃花粉公司均是在对园区感病情况不明的情况下，从不同园区收集雄花制粉，未经灭菌处理直接供应给买家，导致国内大部分花粉产品均携带溃疡病菌。同时，由于近年来部分园区追求结果面积及产量，雄株栽培较少，雌雄株比例不协调，主要依靠人工授粉，从而大量使用带菌花粉授粉，加速了病害传播，导致国内猕猴桃溃疡病感病情况日益严重。因此，尽快研究出能准确快速检测花粉是否携带溃疡病菌的方法，对我国猕猴桃产业的发展至关重要。猕猴桃溃疡病的诊断技术经历了从表面症状观察→菌落形态观察→显微镜检查→PCR快速检测4个阶段。近年来，不少学者对猕猴桃溃疡病菌(Psa)分子检测技术进行了研究，其中2010年，Rees-George等人基于rDNA的16-23S内转录间隔区(ITS序列)设计了1对猕猴桃溃疡病菌的特异性鉴定引物(PsaF1、PsaR2)，其可靠性及准确率相对较高，但该对引物无法区分与溃疡病菌近缘的物种，如P.syringaepv.theae等(Plantpathology,2010,59:453-464)。2017年，申请人与新西兰前沿科学研究所合作，对全球猕猴桃溃疡病菌的起源进化及遗传结构进行了分析，确定了中国猕猴桃溃疡病虽然遗传多样性丰富，与国外菌株间存在较大基因差异,但均同属于第三类型(GenomeBiologyandEvolution,2017,9:932-944.)。因此，本研究基于前期研究中收集的来自于陕西、四川、贵州、河南、湖北等主产区的中国大量溃疡病菌株的关键致病基因hopz5序列，重新设计引物，实验结果证明该对引物可高效可靠地用于中国猕猴桃溃疡病菌的快速鉴定。因此，该引物对的使用可使我们尽快准确地确定花粉样本中是否携带溃疡病菌，防止溃疡病的继续大规模传播，同时促进了该病原菌以DNA为基础的检测方法的发展。截止目前，尚未有针对猕猴桃花粉进行溃疡病感病情况快速鉴定方法的专利报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术的不足，提供一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法；本专利技术能在2天时间内实现花粉样本的快速溃疡病鉴定。本专利技术的目的是这样实现的：首先，利用组织匀浆技术释放分离猕猴桃花粉样本中的细菌，通过培养使其增殖，并运用高温裂解的方法获得样本的DNA；随后，基于特异性引物扩增是否出现条带，确定病原菌中是否含有Psa病原菌。一、方法具体地说，本方法包括以下步骤：①病原菌的分离取0.5g猕猴桃花粉，置于500μL10mmol/LMgSO4溶液中进行匀浆，45Hz研磨120s，即得匀浆液；②病原菌的培养取100μL匀浆液涂布在固体KB培养基上，将平板置于24℃培养过夜；③病原菌的菌落PCR检测A、模板DNA的制备吸取40μL无菌水置于平板上，用无菌接种环刮擦菌苔，尽可能使平板上的菌落悬浮在无菌水中，形成菌悬液，再将菌悬液置于98℃裂解10min之后涡旋，闪离，吸取2μL上清液用于DNA模板；B、引物序列正向引物为hopZ5-1F：5’-AGGATGACGTTCGCACAATGTTAAT-3’(SEQNO.1)；反向引物为hopZ5-1R：5’-GCTGTTCTTCAATGGCATCGTTTAT-3’(SEQNO.2)；预期扩增产物长度为405bp；C、菌落PCR扩增体系反应体系为10μL，其中10×PCRbuffer1μL，10mmol/LdNTP0.2μL，100μmol/L正向引物PsaF10.1μL，100μmol/L反向引物PsaR20.1μL，5U/μLTaq酶0.1μL，DMSO0.2μL，菌落模板2μL，无菌去离子水6.3μL；D、PCR扩增反应程序95℃预变性5min，94℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸5min，-20℃保存；E、取PCR扩增产物5μL，用2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如在405bp处出现单一扩增条带，可初步鉴定该样本含有猕猴桃溃疡病病原菌。二、应用用于猕猴桃花粉是否携带溃疡病菌的快速准确鉴定。三、工作机理本方法首先利用组织匀浆技术释放分离猕猴桃花粉样本中的细菌，通过24℃培养使其增殖，长满平板；随后刮取平板上的菌落，直接采用菌体热裂解后释放出的DNA作为模板，进行Psa特异性扩增，基于特异性条带的有无，确定病原菌中是否含有Psa病原菌。本专利技术具有下列优点和积极效果：①通过组织匀浆、细菌培养和高温裂解获得DNA及PCR特异性扩增等方法，实现了猕猴桃花粉样本的溃疡病感病情况的快速鉴定，促进了该病原菌以DNA为基础的快速检测方法的发展；②具有操作简单、灵敏性高和特异性强等特点，且检测结果准确、客观，对提高猕猴桃花粉的溃疡病检测效率及灵敏度具有重要意义；③适用于准确检测猕猴桃花粉是否含有猕猴桃溃疡病菌，将有效推动猕猴桃的科研、育种及生产，具有广阔的应用前景。附图说明图1为实施例1中河南西峡疑似感病样本经SEQNO.1、SEQNO.2引物菌落PCR检测图片。图2为实施例2中安徽金寨疑似感病样本经SEQNO.1、SEQNO.2引物菌落PCR检测图片。具体实施方式下面结合附图和实施例详细说明：实施例一：共收集河南省西峡县不同果园采集的花粉样本共计9份。①病原菌的分离取0.5g猕猴桃花粉，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法，其特征在于：/n①病原菌的分离/n取0.5g猕猴桃花粉，置于500μL10mmol/LMgSO

【技术特征摘要】
1.一种猕猴桃花粉的溃疡病快速检测方法，其特征在于：
①病原菌的分离
取0.5g猕猴桃花粉，置于500μL10mmol/LMgSO4溶液中进行匀浆，45HZ研磨120s，即得匀浆液；
②病原菌的培养
取100μL匀浆液涂布在固体KB培养基上，将平板置于24℃培养过夜；
③病原菌的菌落PCR检测
A、模板DNA的制备
吸取40μL无菌水置于平板上，用无菌接种环刮擦菌苔，尽可能使平板上的菌落悬浮在无菌水中，形成菌悬液，再将菌悬液置于98℃裂解10min之后涡旋，闪离，吸取2μL上清液用于DNA模板；
B、引物序列
正向引物为hopZ5-1F：5’-AGGATGACGTTCGCACAATGTTAAT-3’——SEQNO.1；
反向引物为hopZ5-1R：5’-GCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李黎，钟彩虹，潘慧，邓蕾，汪祖鹏，张莹华，
申请(专利权)人：中国科学院武汉植物园，
类型：发明
国别省市：湖北;42