脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，试剂盒包括：核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品；脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物和探针；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物和探针；流感嗜血杆菌基因的扩增引物和探针；内参RNP基因的扩增引物和探针。同时还提供了脑炎脑膜炎核酸分型检测方法。本发明专利技术引入了脑炎脑膜炎特异性的多通道引物探针，既可减少工作量，又避免其他检测方法特异性不高、容易漏诊和误诊的问题，还能实现同一体系多重同时检测三种病原体且各通道引物探针相互无干扰，具有敏感性好、特异性高、准确可靠、快速方便等优势，从而快速诊断是否感染三种病原体。

Detection kit and method of nucleic acid typing for meningitis

【技术实现步骤摘要】
脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法
本专利技术属于生物
，涉及一种RT-PCR扩增技术，具体涉及一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
脑膜炎和脑炎是一类可由细菌，病毒，酵母菌引起的主要威胁儿童生命的综合征。发病率和死亡率很高，尤其是细菌真菌类脑膜炎。我国五岁以下的儿童中的急性细菌脑膜炎的发病率为(6.95～22.3)/10,000，脑膜炎和脑炎都是由于中枢神经系统的感染所致，有40％的病人感染后，病程进展较快，直接导致死亡，存活者也会留下神经功能方面的缺陷。脑炎和脑膜炎可能同时存在，成为脑炎脑膜炎，或者有相同的症状，例如头痛发热。据报道，肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌，是最为流行的三种病原菌。肺炎链球菌(pneumococcus)属于革兰染色阳性菌，肺炎球菌主要的致病物质是肺炎球菌溶血素及荚膜。荚膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依据。此菌可引起大叶性肺炎、脑膜炎、支气管炎等疾病，是世界范围内引起儿童和成人感染脑膜炎的主要病原菌，澳大利亚在2016年共有1636例肺炎球菌的病例，被诊断为脑膜炎的共有126例，在澳大利亚的侵入性疾病中对盘尼西林敏感的占到10～12％，因此在讨论经验性治疗方案时，这是非常值得考虑的。在三个月到五岁的儿童中，肺炎链球菌是导致细菌性脑膜炎的主要病因，据估计在我国每年在一个月到五十个月的儿童中，肺炎球菌脑膜炎的发病率为14/10万。脑膜炎奈瑟菌，也叫脑膜炎双球菌，是一群革兰染色阴性双球菌。脑膜炎双球菌(meningococcus)的流行程度因地理位置而不同，A血清型主要在亚撒哈拉的脑膜炎地带(到非洲和中东的旅行者推荐注射针对该病原菌的疫苗)，B血清型主要在发达国家，据报道在2015年，澳大利亚的182例脑膜炎球菌感染的患者中，有53例被诊断为脑膜炎球菌脑膜炎。从2005～2010年，我国的脑膜炎球菌的发病率平均为0.09/每10万人，新疆为发病率最高的地方，安徽省占据大多数案例，1岁以下的儿童发病率最高，在已确认的病例中，ABC三种血清型所占的比例分别为37.2％、11.5％和42.7％。流血嗜血杆菌简称流感细菌，是寄居于人类上呼吸道的正常菌群，属嗜血杆菌属，本属细菌因人工培养时必须加新鲜血液或血液成分方能生长，故名嗜血杆菌。流感嗜血杆菌是嗜血杆菌属中最常见的对人有致病性的细菌，可引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染。流感嗜血杆菌还是导致儿童脑膜炎，肺炎，会厌炎的主要病原菌，尤其是在五岁以下的儿童中，世界范围内每年致使2000万新增病例，30万死亡病例，作为儿童防疫工作的一部分，在使用了流血嗜血杆菌疫苗的国家，感染情况已经大大减少。在美国由于使用了疫苗，十年间，每年的五岁以下发病人数已由10000例减少至200例。荧光定量PCR技术是一种传统的生物分子检测方法，具有高敏感、高特异、高准确性且能实现多重实时检测的优势，目前已被广泛用于核酸(DNA/RNA)分子检测。目前，在中国专利文献中公开的涉及脑炎脑膜炎核酸检测的试剂主要有：中国专利文献CN201610296666.5公开了一种检测细菌性脑膜炎病原体的多重PCR试剂盒，能够快速检测六种细菌性脑膜炎病原体，肺炎链球菌(SP)、无乳链球菌(GBS)、流感嗜血杆菌(HI)、单核细胞增生李斯特菌(LM)、金黄色葡萄球菌(SA)、脑膜炎奈瑟菌(NM)，检测方法为多重PCR法，通过电泳检测扩增结果；由于产物需开盖检测带来潜在污染的可能，而且该方法操作复杂，检测灵敏度低于荧光定量PCR法。中国专利文献CN201310031419.9公开了一种同步检测二十三种脑炎脑膜炎病原体的试剂盒及其检测方法，可检测包括脑膜炎奈瑟菌、b型流感嗜血杆菌、葡萄球菌、肺炎链球菌等在内的病原体，其检测方法为毛细管电泳法，由于产物需开盖检测带来潜在污染的可能，并且操作较为繁琐，检测时间长，检测灵敏度低于荧光定量PCR法。中国专利文献CN201110004826.1公开了一种对脑膜炎奈瑟氏菌的ITS特异的核苷酸及其应用，利用该荧光定量PCR试剂盒对人体及环境中的脑膜炎奈瑟氏菌进行检测，可用于食品和临床样品的监督和检测、食物中病原菌检测、细菌学分类及流行病学调查等领域，但是其主要不足在于检测样本时，目标过于单一。虽然现有技术中针对脑炎脑膜炎的病原体检测试剂盒已经有很多，但是在荧光定量PCR技术平台针对肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌的三重检测方法未见报道，因此，本领域技术人员亟有必要利用该平台开发一种高敏感、高特异、高准确性的多重实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒，实现三重联合检测并区分肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。
技术实现思路
针对上述现有技术中的不足，本专利技术要解决的技术问题是提供一种高敏感、高特异、高准确性的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒及检测方法，能够快速检测三种细菌病原体，实现三重联合检测并区分肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。为实现上述目的之一提供一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，本专利技术采用了以下技术方案：一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，所述试剂盒包括核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。优选的，所述核酸快速提取试剂包括：pH为10.0的400mMTris-HCl、5vol％的Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mMKCl、pH为8.0的4mMEDTA。优选的，所述PCR扩增试剂包括：1.5×PCRbuffer、4mMMgCl2、pH为10.0的50mMTris-HCl、0.5mMdNTP、0.02U/μlDNA聚合酶、5wt％BSA。优选的，所述阳性对照品包括：将肺炎链球菌的特异性扩增片段、脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段、流感嗜血杆菌的特异性扩增片段和内参RNP的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。优选的，所述阴性对照品为DEPCH2O。优选的，所述脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物F1、R1和探针P1；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物F2、R2和探针P2；流感嗜血杆菌基因的扩增引物F3、R3和探针P3；内参RNP基因的扩增引物F4、R4和探针P4；探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；引物探针序列为：肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’肺炎链球菌-P1：5’-FAM-ACTGCTCACGGCTA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：/n所述试剂盒包括核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。/n

【技术特征摘要】
1.一种脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述试剂盒包括核酸快速提取试剂、PCR扩增试剂、脑炎脑膜炎核酸检测试剂、阳性对照品、阴性对照品。


2.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述核酸快速提取试剂包括：pH为10.0的400mMTris-HCl、5vol％的Tween20、500mM异硫氰酸胍、40mMKCl、pH为8.0的4mMEDTA。


3.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述PCR扩增试剂包括：1.5×PCRbuffer、4mMMgCl2、pH为10.0的50mMTris-HCl、0.5mMdNTP、0.02U/μlDNA聚合酶、5wt％BSA。


4.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述阳性对照品包括：将肺炎链球菌的特异性扩增片段、脑膜炎奈瑟菌的特异性扩增片段、流感嗜血杆菌的特异性扩增片段和内参RNP的特异性扩增片段分别连接到四个pUC57质粒载体上，四个质粒分别用DEPC水进行106倍稀释，然后将四个稀释后的质粒等体积混合，作为最终的阳性对照。


5.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述阴性对照品为DEPCH2O。


6.根据权利要求1所述的脑炎脑膜炎核酸分型检测试剂盒，其特征在于：
所述脑炎脑膜炎核酸检测试剂包括：肺炎链球菌基因的扩增引物F1、R1和探针P1；脑膜炎奈瑟菌基因的扩增引物F2、R2和探针P2；流感嗜血杆菌基因的扩增引物F3、R3和探针P3；内参RNP基因的扩增引物F4、R4和探针P4；
探针P1的5’端标记有报告荧光染料FAM，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P2的5’端标记有报告荧光染料VIC，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P3的5’端标记有报告荧光染料CY5，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
探针P4的5’端标记有报告荧光染料ROX，3’端标记有淬灭荧光染料BHQ；
引物探针序列为：
肺炎链球菌-F1：5’-AAGCCGTTCTCAATATCATGCTTA-3’
肺炎链球菌-R1：5’-CACGTTGACCCTTATCCATATCTTG-3’
肺炎链球...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨孙孝，朱兆奎，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31