一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法技术

本发明专利技术公开了一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，首先采用气质联用技术对普通玉米花粉代谢组提取液进行快速分析，得到其全面的代谢轮廓谱。首次系统鉴定了花粉中含有的67种初生代谢物。然后针对67种初生代谢物建立一种靶标代谢组分析方法，可以一次性对玉米花粉初生代谢组进行定量分析。包括:样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结果鉴定、代谢物的定量分析。该方法重复性好，稳定性高，快速可靠，适用于玉米花粉以及其他作物花粉样品的初生代谢组分析。

A high throughput mass spectrometry method for the detection of primary metabolites in corn pollen

The invention discloses a mass spectrometry method for high-throughput detection of primary metabolites in corn pollen. Firstly, GC-MS technology is used for rapid analysis of the extract of metabolome of common corn pollen to obtain a comprehensive metabolic profile spectrum. 67 kinds of primary metabolites in pollen were identified systematically for the first time. Then, a target metabolome analysis method was established for 67 kinds of primary metabolites, which can be used for quantitative analysis of primary metabolome of maize pollen. It includes: sample pretreatment, GC-MS separation, metabolite result identification, metabolite quantitative analysis. The method has good repeatability, high stability, high speed and reliability, and is suitable for the analysis of primary metabolome of corn pollen and other crop pollen samples.

【技术实现步骤摘要】
一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法
本专利技术涉及化学检测
，具体为一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法。
技术介绍
新陈代谢是生物所共有的生命过程，植物的新陈代谢可分为初生代谢和次生代谢两个过程。初生代谢物是生物的一种重要代谢物，为生命体的生长发育繁殖提供能源和中间产物，也称为营养物质。代谢组学是通过对一个生物系统的细胞在给定条件下所有内源性代谢物质进行定性定量，进而对其整体及其对内在因素和外在因素变化应答的规律进行检测的科学。主要基于GC-MS，LC-MS，NMR等常见技术。花粉既是植物雄蕊里的细小颗粒，也是遗传后代的雄性细胞，它蕴含极高的营养价值与保健功效，被誉为“微型营养库”，在世界范围内被广泛应用于日用品制作，食品加工与开发，以及药物研制等方面。目前已被利用的花粉源植物有9000多种，其中最大的花粉源植物是玉米，作为我国三大粮食作物之一的玉米具有产量大、易于采收等优点，这也为玉米花粉的开发与研究提供了丰富的资源。玉米花粉已被列入我国的新资源药食同源食品，它富含多种营养成分，具有增强免疫、促进生长发育、降血压、抑菌、抗辐射、抗衰老、抑制肿瘤等医疗保健及药理功能。有关研究发现对这些保健作用起主要作用的是玉米花粉中的多糖、黄酮、氨基酸、维生素、蛋白质、核酸等有效成分，其中多糖、氨基酸、维生素、蛋白质、核酸等活性成分是植物中主要的初生代谢产物，而这些化学成分的积累与玉米花粉体外抑菌、预防瘟疫、抑制肿瘤等功能有着密切联系。目前关于玉米花粉的研究多集中在活力测定、破壁、单一的或几种化学成分分析、保健作用等方面，而一次性高通量地对花粉中初生代谢物的定性定量分析(初生代谢组)的方法研究暂时没有见到报道。所以如果能够实现一次性对玉米花粉中存在的初生代谢物进行鉴定和定量，那么我们对玉米花粉的营养价值及保健功效就能有更深入更全面的了解，为此我们提出一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法用于解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，包括如下步骤：S1、花粉样品的前处理：将采集的玉米花粉存放于-196℃的液氮罐中猝灭30分钟，终止代谢反应，再转移到-80℃冰箱中存放待用，将从冰箱中取出的花粉样品置于研钵中，加入液氮冷冻并研磨成粉末破壁后，装入15mL离心管中再于-80℃冰箱中保存留待分析；S2、花粉代谢物的萃取：准确称量50mg玉米花粉粉末样品于2mL的离心管中，加入1mL预冷至-20℃的提取液A及10μL13C标记D-核糖醇(1mg/mL)内标物，充分混匀至样品完全重悬，而后将样品置于振摇仪上振摇，振摇后将非接触式超声仪设置为高能能量，启动10秒，关闭10秒，30个循环，在冰水浴条件下超声，然后再加入500μL的甲醇水混合液混匀后进行离心，而后吸取200μL下层清液于1.5mL的离心管中，在室温下真空浓缩干燥2小时得到花粉代谢物；S3、代谢物的衍生化处理：往真空浓缩干燥后的样品中加入50μL甲氧基胺盐酸盐(20mg/mL，吡啶溶液)，充分混匀后置于振摇仪上振摇，70μL硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺，充分混匀后置于振摇仪上振摇，随后再将反应后的样品转移到带有150μL内插管的进样瓶中待用；S4、GC-MS检测：样品采用气相色谱质谱联用仪进行检测，采用全扫描和选择离子监测分别进行扫描，先用全扫描方式采集数据进行代谢物定性分析，准确定性了玉米花粉中的67种物质，得到67种物质的保留时间、特征离子碎片，然后根据保留时间和特征离子碎片，采用选择离子监测方式对67种物质进行准确定量分析。优选的一种实施案例，步骤S2中，样品振摇条件为：4℃，300rpm条件下振摇10分钟，甲醇水混合液中水和甲醇按体积比为3:1，离心条件为4℃，14000rpm条件下离心10分钟。优选的一种实施案例，步骤2中，所述提取液A以重量份计，其原料组成包括：20-35份甲醇、65-80份甲基叔丁基醚(MTBE)、0.03-0.07份1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、0.02-0.03份氨苄青霉素和0.02-0.03黑芥子苷。优选的一种实施案例，所述提取液A以重量份计，其原料组成包括：25份甲醇、0.5份1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、75份甲基叔丁基醚(MTBE)、25份氨苄青霉素和25黑芥子苷。优选的一种实施案例，所述提取液A以重量份计，其原料组成包括：30份甲醇、0.6份1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、70份甲基叔丁基醚(MTBE)、27份氨苄青霉素和23黑芥子苷。优选的一种实施案例，所述氨苄青霉素为1mg/mL的水溶液，所述1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine为1mg/mL的氯仿溶液，所述黑芥子苷为1mg/mL的水溶液。优选的一种实施案例，步骤3中，样品加入甲氧基胺盐酸盐后的振摇条件为37℃，200rpm条件下振摇肟化反应120分钟，加入硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅烷三氟乙酰胺后的振摇条件为在37℃，200rpm条件下振摇硅烷化反应30分钟。优选的一种实施案例，步骤S4中，所述气相色谱质谱联用仪为5975CGC+7890AMSD气相色谱质谱联用仪(安捷伦公司)，7693自动进样器，DB-35MSUI毛细管色谱柱(30mx0.25mm,0.25μm)。优选的一种实施案例，步骤S4中，气相色谱以氦气(纯度>99.999％)为载气，进样量为1μL，流速设置为1mL/分钟，分流比50:1，进样口温度为270℃，升温程序为90℃恒温4分钟，而后以8℃/分钟升温到205℃，保持2分钟，再以15℃/分钟升温到310℃，持续2分钟。质谱设置离子传输线温度为300℃，离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，EM电压为1459V，质量扫描范围为m/z85-700，总检测时间为32分钟，其中溶剂延迟时间为4分钟。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：通过提取液A充分提取花粉中的初生代谢物，再通过振摇和非接触式超声辅助，以及离心萃取出特征物质，采用GC-MS技术对普通玉米花粉代谢组提取液进行快速分析，得到其全面的代谢轮廓谱，首次系统鉴定了花粉中含有的67种初生代谢物；针对初生代谢物建立一种靶标代谢组分析方法，可以一次性对玉米花粉初生代谢组进行定量分析，该方法重复性好，稳定性高，快速可靠，适用于玉米花粉以及其他作物花粉样品的初生代谢组分析。附图说明图1为本专利技术基于GC-MS检测玉米花粉代谢物的总离子流图。图2为本专利技术基于GC-MS检测玉米花粉中67种代谢物的定量离子色谱图。具本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，其特征在于，包括如下步骤：/nS1、花粉样品的前处理：将采集的玉米花粉存放于-196℃的液氮罐中猝灭30分钟，终止代谢反应，将猝灭后的花粉样品置于研钵中，加入液氮冷冻并研磨成粉末，装入15mL离心管中再存于-80℃冰箱备用；/nS2、花粉代谢物的萃取：准确称量50mg玉米花粉粉末样品于2mL的离心管中，加入1mL预冷的提取液A及10μL

【技术特征摘要】
1.一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、花粉样品的前处理：将采集的玉米花粉存放于-196℃的液氮罐中猝灭30分钟，终止代谢反应，将猝灭后的花粉样品置于研钵中，加入液氮冷冻并研磨成粉末，装入15mL离心管中再存于-80℃冰箱备用；
S2、花粉代谢物的萃取：准确称量50mg玉米花粉粉末样品于2mL的离心管中，加入1mL预冷的提取液A及10μL13C标记-D核糖醇(1mg/mL)内标物，充分混匀至样品完全重悬，将样品置于振摇仪上振摇，然后置于非接触式超声仪提取，将仪器设置为高能能量，启动10秒，关闭10秒，30个循环，在冰水浴条件下超声，超声后再加入500μL的甲醇水混合液混匀后进行离心，而后吸取200μL下层清液于1.5mL离心管中，在室温下真空浓缩干燥2小时得到花粉代谢物的提取物；
S3、代谢物的衍生化反应：往已干燥后的样品提取物中加入50μL甲氧氨基盐酸盐(20mg/mL，吡啶溶液)，充分混匀后置于振摇仪上振摇，再补充加入70μL硅烷化试剂N-甲基-N三甲基硅三氟乙酰胺，充分混匀后置于振摇仪上振摇，随后将反应结束的样品溶液转移到带有150μL玻璃内插管的进样瓶中待用；
S4、气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分析：样品采用GC-MS进行分析，分别选择“全扫描模式”和“选择离子监测模式”进行数据采集，先用全扫描方式采集数据进行代谢物定性分析，准确定性了玉米花粉中的67种物质初生代谢物，得到67种物质的保留时间、特征离子碎片，然后根据保留时间和特征离子碎片，采用选择离子监测方式对67种物质进行准确定量分析。


2.根据权利要求1所述的一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，其特征在于：步骤S2中，样品振摇条件为：4℃，300rpm条件下振摇10分钟，甲醇水混合液中水和甲醇按体积比为3:1，离心条件为4℃，14000rpm条件下离心10分钟。


3.根据权利要求1所述的一种高通量检测玉米花粉中初生代谢物的质谱方法，其特征在于，步骤2中，所述提取液A以重量份计，其原料组成包括：20-35份甲醇、65-80份甲基叔丁基醚(MTBE)、0.03-0.07份1,2-diheptadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine、0.02-0.03份氨苄青霉素和0.02-0.03黑芥子苷。


4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：晏石娟，黄文洁，陈庄，孔谦，张群洁，
申请(专利权)人：广东省农业科学院农业生物基因研究中心，
类型：发明
国别省市：广东;44