枯草芽孢杆菌分离株和其用途制造技术

本发明专利技术涉及枯草芽孢杆菌分离株和其用途。本发明专利技术提供枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分离株、制备其发酵萃取物的方法、其发酵提取物、包含其发酵提取物的组合物，和其发酵提取物用于促进软骨细胞再生、增加软骨细胞外间质分泌和/或治疗关节炎的用途。

Isolation and application of Bacillus subtilis

【技术实现步骤摘要】
枯草芽孢杆菌分离株和其用途
本专利技术涉及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分离株、利用所述分离株制备发酵提取物、包含所述发酵提取物的组合物和所述发酵提取物于促进软骨细胞再生、增加软骨细胞外间质分泌和/或治疗关节炎的用途。
技术介绍
骨关节炎(Osteoarthritis)是全世界最常见的关节疾病且与年龄有直接的关系，是老年人行动不便的头号原因。有越来越多的证据显示(勒塞R.F.(Loeser,R.F.)2008,肌骨与神经元交互作用杂志(J.MusculoskeletNeuronalInteract)；8(4):303-306)，细胞因子、趋化因子和其它炎症介质的产生是造成骨关节炎中的软骨降解的因素。这些炎症因子通常透过影响免疫细胞和滑膜细胞而引发关节炎，骨关节炎会由软骨细胞产生炎症介质，包括细胞因子和趋化因子，例如介白素-1(interleukin-1，简称IL-1)、IL-6、IL-7、IL-8、IL-17、IL-18、单核细胞趋化蛋白(monocytechemotacticprotein-1，简称MCP-1)、白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，简称LIF)、生长调节致癌基因(growth-regulatedoncogene，简称GRO)和制瘤素M和活性氧物质(reactiveoxygenspecies，简称ROS)，例如：一氧化氮(NO)，过氧化氢(H2O2)和过氧亚硝酸盐，以及脂质衍生的炎症介质(例如前列腺素(prostaglandin)和白三烯(leukotriene)等物质)，会促使软骨细胞产生蛋白水解酶(proteolyticenzyme；proteinase)，这包含聚蛋白聚糖酶(aggrecanase)和基质金属蛋白酶(matrixmetalloprotease，简称MMP)等。小林正彦(MasahikoKobayashi)等人(2005,类风湿性关节炎(ArthritisRhemu),52:128-35)的研究显示，IL-1β会促使软骨细胞的MMP(如MMP-1和MMP-13)表达增加，而MMP-1和MMP-13会降解细胞外间质中的胶原蛋白II(collagenII)和聚蛋白聚糖(aggrecan)。IL-1β和TNF-α都可以诱发人类软骨肉瘤细胞(SW1353)产生骨关节炎相关发炎性物质(例如细胞因子(cytokine)、前列腺素和一氧化氮)，和活化蛋白水解酶，还会抑制软骨细胞的增生(proliferation)，导致胶原蛋白II以及聚蛋白聚糖降解。骨关节炎患者的软骨细胞再生速率较慢，且其分泌胶原蛋白II以及聚蛋白聚糖等细胞外间质的能力下降，因此关节易产生发炎的现象。世界卫生组织(WHO)的调查显示全球罹患骨关节炎的患者逐年增加，而台湾卫生福利部的统计资料也指出国人膝关节退化的盛行率约为15％，推估有350万人饱受膝关节疼痛之苦，且随着运动风气盛行，很多人的膝盖常因不当使用，使患者年龄层由60、70岁逐渐下降，出现年轻化趋势。由于具有关节退化问题的人口增多，关节保健产品的需求也随着增加。然而现行相关产品的原料主要以葡萄糖胺(glucosamine)或硫酸软骨素(chondroitinsulfate)为主。这些原料主要是提取自动物组织，然而由于动物疾病(例如：禽流感、狂牛症和口蹄疫等)和鱼类重金属污染等问题的存在，因此无动物成分的保健产品渐渐受到重视，且使用微生物发酵法生产相关保健产品渐成为各界的研究重点(迪安杰利斯P.L.(DeAngelis,P.L.),2012.应用微生物学与生物技术(Appl.Microbiol.Biotechnol.)94:295-305)。本专利技术透过筛选具有促进软骨再生和抗关节发炎效果的微生物发酵物，以开发有潜力应用于骨关节保健的产品。
技术实现思路
本专利技术主要的目的在于提供可以产生促进软骨细胞再生、增加软骨细胞外间质分泌和/或治疗关节炎效果的发酵提取物的枯草芽孢杆菌分离株。因此，本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌分离株，其是寄存于财团法人食品工业发展研究所且寄存编号为BCRC910842或BCRC910843的菌株，或是与寄存于财团法人食品工业发展研究所且寄存编号为BCRC910842或BCRC910843的菌株具有基本上完全相同特征的变异株。本专利技术另提供一种制备枯草芽孢杆菌发酵提取物的方法，其包含：(a)将前述的枯草芽孢杆菌分离株接种于培养基中；(b)在适当环境下培养所述经接种的培养基以获得发酵物；(c)从所述发酵物中去除所述枯草芽孢杆菌菌株以获得上清液；(d)将所述上清液以体积比为约1:1至约1:9的比例与100％乙醇混合以产生沉淀物；和(e)收集所述沉淀物。本专利技术另提供一种枯草芽孢杆菌发酵提取物，其可以由如前述的方法获得。本专利技术另提供一种组合物，其包含治疗有效量的前述枯草芽孢杆菌发酵提取物。本专利技术另提供一种前述的枯草芽孢杆菌发酵提取物的用途，其是用于制备促进软骨细胞再生、增加软骨细胞外间质分泌和/或治疗关节炎的药物。附图说明图1A显示P12-3C菌株的发酵提取物的HPLC图谱。图1B显示P32-7B菌株的发酵提取物的HPLC图谱。图2显示199菌株、P12-3C菌株和P32-7B菌株的发酵提取物调节IL-1β诱发SW1353生成IL-8的效果。图3显示P12-3C菌株的发酵提取物促进软骨细胞增生的效果。图4显示P12-3C菌株的发酵提取物对软骨细胞糖胺聚糖(glycosaminoglycan，简称GAG)分泌量的影响。图5显示P12-3C菌株的发酵提取物对软骨细胞细胞外间质(extracellularmatrix，简称ECM)相关基因表达的影响。图6显示P12-3C菌株的发酵提取物调节IL-1β诱发SW1353生成ROS的效果。图7显示P12-3C菌株的发酵提取物物调节IL-1β诱发SW1353的金属蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-8、MMP-10和MMP-13)表达的效果。图8显示P12-3C菌株的发酵提取物调节金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4)表达量的效果。图9显示P12-3C菌株的发酵提取物调节IL-1β诱发SW1353生成MMP-1、MMP-3、MMP-13和IL-8和TIMP-1的效果具体实施方式参考以下对本专利技术的每个方面、实例、和伴随相关描述的化学图式和表格的详细描述，可以更容易地了解本专利技术。在公开和描述本专利技术的菌株、发酵提取物、组合物和/或方法之前，应了解，除非由权利要求书另外特别地指出，否则本专利技术不受限于特定制备方法、载剂或调配物、或将本专利技术发酵提取物调配成用于局部、经口或肠胃外投予的产物或组合物的特定模式，这是由于相关领域普通技术人员非常清楚这些事情是可以加以变化的。还应了解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的而不意欲用于限制性本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分离株，其是寄存于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养保藏中心且寄存编号为DSM32867或DSM32870的菌株，或是与寄存于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养保藏中心所且寄存编号为DSM32867或DSM32870的菌株具有基本上完全相同特征的变异株。/n

【技术特征摘要】
20180831 TW 1071306751.一种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)分离株，其是寄存于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养保藏中心且寄存编号为DSM32867或DSM32870的菌株，或是与寄存于莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养保藏中心所且寄存编号为DSM32867或DSM32870的菌株具有基本上完全相同特征的变异株。


2.一种制备枯草芽孢杆菌发酵提取物的方法，其包含：
(a)将根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌分离株接种于培养基中；
(b)在适当环境下培养所述经接种的培养基以获得发酵物；
(c)从所述发酵物中去除所述枯草芽孢杆菌菌株以获得上清液；
(d)将所述上清液以体积比为约1:1至约1:9的比例与100％乙醇混合以产生沉淀物；和
(e)收集所述沉淀物。


3.根据权利要求2所述的方法，其中步骤(a)中的接种量为每克培养基接种约107CFU至约1010CFU的所述分离株。


4.根据权利要求2或3所述的方法，在步骤(b)中，所述经接种的培养基是在含氧下培养于约20℃至约40℃的温度中。


5.根据权利要求2或3所述的方法，在步骤(d)中，所述上清液与100％乙醇的混合体积比为约1:4。


6.根据权利要求2或3所述的方法，其中更包含：
(f)干燥所述沉淀物。


7.根据权利要求6所述的方法，其中更包含：
(g)将所述沉淀物溶入适当的溶剂中。


8.根据权利要求7所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈彦霖，叶怡真，廖巧敏，林玟繽，
申请(专利权)人：财团法人食品工业发展研究所，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71