一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用，所述的高地芽孢杆菌为高地芽胞杆菌（

A high ground bacillus J45 and its acquisition and Application

【技术实现步骤摘要】
一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种高地芽孢杆菌J45及其获取方法与应用。
技术介绍
烟草特有的N-亚硝基类化合物（TSNAs）是一类重要的胺类化合物，其中NNN、NNK、NAB、NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，而NNK和NNN对啮齿动物具有强烈的癌物性。减害技术作为国际烟草的研究重点已取得了很多突破，其中主要包括农业技术中的品种选育与栽培技术、烘烤调制技术、生物技术和物理技术等，这些技术的应用可以调控TSNAs的形成量。微生物在TSNAs的形成中起着重要作用，在调制过程中改变微生物活性和数量，也必然会影响TSNAs的累积。在TSNA的两条形成途径中都有微生物在起调节作用。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株能实现烟草特有亚硝胺碱定向降解且抗逆性好的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，采取适宜的施用方法，对于生产优质低害的烟叶，提高烟叶安全性和综合品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一株高地芽孢杆菌J45；第二目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的获取方法；第三目的在于提供所述的高地芽孢杆菌J45的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，一株高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis），命名为J45，经鉴定为高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2019年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：中国，武汉，中国武汉大学保藏中心，邮编430072），其保藏编号为CCTCCNo.M2019666。本专利技术的第二目的是这样实现的，包括分离、筛选及纯化与验证工序，具体包括：A、分离：将烟株组织研磨后用无菌水清洗，进行表面消毒。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成小段，置于磷酸钾缓冲液中，用超声波处理，用纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集滤膜上。将滤膜至于无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。离心收集菌体，溶于无菌水中，将获得的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；培养条件为：25~30℃，时间40~55h；分离培养基成分以g/L计为：琼脂12.0~18.0、K2HPO41.4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4•7H2O0.1~0.3、CaCl20.04~0.06、MnSO4•H2O0.001~0.003、CuSO4•5H2O0.0001、ZnSO4•7H2O0.0002、NaMoO4•2H2O0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH6.5~7.5；B、筛选：将分离出的菌株转均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；培养条件为：30℃，时间48~72h；筛选培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO46.0、KH2PO43.0、NaCl0.5、MgSO40.12、CaCl20.1、nicotine0.5；C、纯化与验证：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性，即高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45；培养条件为：25~30℃，时间48h；纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5。本专利技术的第三目的是这样实现的：一种所述高地芽胞杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：a、发酵：首先将高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45接种到斜面培养基上，得到发酵种子；培养条件为：25~30℃，时间24~36h；斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaCl4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.5。然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3~5v/v%，摇瓶装液量为25~35v/v%，得到发酵菌剂；培养条件为：25~30℃，时间24~36h；种子培养液成分以g/L计为：胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaCl4.0~6.0；b、接种：在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。本专利技术所述短高地芽胞杆菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点：1、本专利技术所述高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达27.64~52.37%。2、本专利技术所述短高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45大量存在于烟株中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。3、本专利技术所述短高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45能在pH4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，NaCl耐受性<9％，具有较好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的一株高地芽胞杆菌（Bacillusaltitudinis）J45，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCCNo.7418。所述菌株为革兰氏阳性，杆状，大小为0.6μm～1.0μm×2.0μm～5.0μm，芽胞端生或次端生，周生鞭毛，能运动。明胶液化、硝酸盐还原酶试验、淀粉水解试验、甲基红试验、V.P试验、均为阳性，氧化酶试验、柠檬酸盐利用试验为阴性，能够利用肌醇、D-山梨醇、甘露糖和蔗糖产酸，不能利用木糖、D-棉籽糖、麦芽糖、鼠李糖产酸。所述菌株可在pH4.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为25～45℃，NaCl耐受性<9％。所述菌株可在以尼古丁为唯一碳源的培养基中生长。所述尼古丁化学结构为1-甲基-2-（3-吡啶基）-四氢吡咯烷(1-METHYL-2-(3-PYRIDYL)-PYRROLIDINE)所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的总本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株高地芽孢杆菌J45，其特征在于所述的高地芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一株高地芽孢杆菌J45，其特征在于所述的高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）J45，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNo.M2019666。


2.根据权利要求1所述的高地芽孢杆菌J45，其特征在于所述的高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）J45菌株可在以尼古丁(Sigma-Aldrich,Germany)为唯一碳源的NIM培养基中生长。


3.根据权利要求1所述的高地芽孢杆菌J45，其特征在于所述的高地芽孢杆菌（Bacillusaltitudinis）J45菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNK、NAB、NAT和NNN的总降解率为27.64~52.37%。


4.一种权利要求1~3任一所述的高地芽孢杆菌J45的获取方法，其特征在于包括分离、筛选和纯化验证步骤，具体包括：
A、分离：将烟株组织经研磨、清洗、消毒、剪成小段置于磷酸钾缓冲液中，超声处理、过滤得到滤液，将滤液再经真空过滤、洗脱、离心收集菌体，菌体溶于无菌水中得到悬浊液，将悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
所述的分离培养基以g/L计为：琼脂12.0~18.0、K2HPO41.4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4•7H2O0.1~0.3、CaCl20.04~0.06、MnSO4•H2O0.001~0.003、CuSO4•5H2O0.0001、ZnSO4•7H2O0.0002、NaMoO4•2H2O0.0002、尼古丁0.8~1.2，pH6.5~7.5；分离培养的温度为25~30℃，培养的时间为40~55h；
B、筛选：将A步骤中分离出的菌株均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的筛选培养基平板上培养得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
所述的筛选培养基成分以g/L计为：琼脂15.0、K2HPO46.0、KH2PO43.0、NaCl0.5、MgSO40.12、CaCl20.1、nicotine0.5；筛选培养的温度为30℃，培养时间为48~72h；
C、纯化验证：将B步骤筛选得到的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化培养获得长势旺盛的单菌落，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性，即高地芽孢杆菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：盖晓彤，卢灿华，雷丽萍，马俊华，姜宁，余清，邹聪明，夏振远，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53