本发明专利技术公开了一种水生产碱菌及其获取方法与应用，所述的水生产碱菌为水生产碱菌（Alcaligenes aquatilis）05‑101，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC No.M2019665。获取方法包括分离、筛选程序，首先从烟株组织中分离能降解尼古丁的菌株，再用以NNK为唯一碳源和氮源的培养基筛选即得。菌株的应用包括发酵、接种、降解工序，首先将菌株在28~30℃下培养36~72 h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按烟草重量的3~5%喷施，保持4~7 d（烤烟）、45~50 d（晾烟）的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。
A kind of water producing alkali bacteria and its obtaining method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种水生产碱菌及其获取方法与应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一种水生产碱菌及其获取方法与应用。
技术介绍
烟草特有亚硝胺（Tobacco-specificN-nitrosamines,TSNAs）是烟草中特有的一类N-亚硝基类化合物，具有潜在的致癌作用，是烟叶中重要的有害成分，对吸烟者的健康存在严重影响。目前，被鉴定出8种物质，其中4-（N-甲基-亚硝胺）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）、N-亚硝基新烟草碱（NAT）、N-亚硝基去甲基烟碱（NNN）以及N-亚硝基假木贼碱（NAB）是烟草和烟气中主要的TSNAs，尤其NNN与NNK均为动物强致癌物，危害极大。因此，降低TSNAs含量是提高烟草安全性的极为重要。TSNAs是生物碱与亚硝酸盐在微生物的作用下形成，因此可通过降低生物碱或亚硝酸盐的含量而调控TSNAs的形成。影响烟草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等。通过这些影响因子的改变可以调控TSNAs的形成量，但目前关于微生物降解TSNAs报道还不多。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，选择适宜的施用方法，对于提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一株水生产碱菌；第二目的在于提供所述的水生产碱菌的获取方法；第三目的在于提供所述的水生产碱菌的应用。本专利技术的第一目的是这样实现的，一株水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis），命名为05-101，经鉴定为水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2019年08月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC，地址为：武汉，武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCCNO:M2019665。本专利技术的第二目的是这样实现的，一种所述水生产碱菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：A、分离：将采集的5g烟株组织用无菌水清洗，于75%酒精中浸泡1min，再用2%的次氯酸钠溶液浸泡3min，然后在75%酒精中浸泡30sec，最后用无菌水冲洗3次。用无菌剪刀将表面消毒的烟草叶片剪成2~3cm的小段，置于45ml磷酸钾缓冲液中(0.1M，pH7.2)，用超声波处理30min，用4层纱布过滤除去烟草叶片。滤液经真空抽滤，将菌体收集至孔径0.2µm滤膜上。将滤膜至于10mL无菌水中，超声波洗脱菌体细胞。13000r/min离心20min收集菌体，溶于1mL无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48~72h。挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基验证其能够以尼古丁作为唯一碳源生长的特性。将最后筛选得到的尼古丁降解菌保存。培养条件为25~30°C，时间36~50h；分离培养基成分以g/L计为：Na2HPO45.8~6.2，KH2PO42.8~3.2，NH4Cl0.8~1.2，NaCl0.48~0.52，MgSO40.10~0.14，CaCl20.08~0.12，尼古丁0.48~0.52，琼脂13~16；B、筛选：将筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接内生降碱细菌于平板上，置于培养箱中培养，筛选获得一株生长较好的菌株；培养条件为25~35°C，时间42~50h；筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO45.8~6.2，KH2PO42.8~3.2，NH4Cl0.8~1.2，NaCl0.48~0.52，MgSO40.10~0.14，CaCl20.08~0.12，NNK0.05~0.15，琼脂13~16；C、纯化与保存：将从NNK为碳源的菌株用无菌牙签划线于纯化培养基，置于培养箱中培养获取单菌落，经两次划线纯化后将菌株保存于20%的甘油中置于-80°C低温冰箱保存。培养条件为25~30°C，时间36~50h；纯化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.5~3.5、氯化钠4.0~6.0、琼脂13~18，pH7.0~7.4。本专利技术的第三目的是这样实现的：一种所述水生产碱菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括：a、发酵：将-80°C保存的菌株05-101用无菌牙签挑取少许划线于活化培养基平板，置于培养箱培养，形成单菌落；用无菌牙签挑取单菌落于盛有5mL的种子培养液的50mL离心管中，置于振荡器振荡培养，获得种子液；将菌株05-101种子液以3~5v/v%加入发酵培养液，恒温振荡培养，当菌体浓度达1010CFU/mL时，即为发酵菌剂；活化培养条件为：温度25~30°C，时间36~60h；种子液培养条件为：转速200~260r/min，温度为25~30°C，时间20~36h；发酵培养条件为：转速200~260r/min，温度25~30°C，时间36~60h；活化培养基成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.5~3.5、氯化钠4.0~6.0、琼脂15.0~19.0，pH7.0~7.4；种子培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.5~3.5、氯化钠4.0~6.0，pH7.0~7.4；发酵培养液成分以g/L计为：蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.5~3.5、氯化钠4.0~6.0，pH7.0~7.4。b、接种：在烟株组织调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施；c、降解：喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7d（烤烟）、40~50d（晾烟）的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT的有效降解。本专利技术所述水生产碱菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点：1、本专利技术所述水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101是一种烟草特有亚硝胺的高效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达6.1~27.1%（烤烟）、14.5~30.6%（晾烟）。2、本专利技术所述水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101大量存在于烟株中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。3、本专利技术所述水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101能在含有0～8.0g/LNaCl，pH3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为25～37℃，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌为水生产碱菌（
【技术特征摘要】
1.一株水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌为水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCCNo.M2019665。
2.根据权利要求1所述的水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101菌株可在以4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1-丁酮（NNK）为唯一碳源的培养基中生长。
3.根据权利要求1所述的水生产碱菌，其特征在于所述的水生产碱菌（Alcaligenesaquatilis）05-101菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNK、NAB、NAT和NNN的总降解率为6.1~27.1%（烤烟）、14.5~30.6%（晾烟）。
4.一种权利要求1~3任一所述的水生产碱菌的获取方法，其特征在于包括分离、筛选和纯化步骤，具体包括：
A、分离：将采集的烟株组织经清洗、消毒、剪成小段置于磷酸钾缓冲液中，超声处理、过滤得到滤液，将滤液再经真空过滤、洗脱、收集菌体，菌体溶于无菌水中，均匀涂布于以尼古丁为唯一碳源的分离培养基，30℃培养48~72h，挑取单菌落分离纯化，将纯化的单菌落再次接种于NIM培养基中于温度25~30℃下培养36~50h验证其能够以尼古丁为唯一碳源生长的特性得到尼古丁降解菌；
所述的分离培养基以g/L计为：Na2HPO45.8~6.2，KH2PO42.8~3.2，NH4Cl0.8~1.2，NaCl0.48~0.52，MgSO40.10~0.14，CaCl20.08~0.12，尼古丁0.48~0.52，琼脂13~16；
B、筛选：筛选培养基灭菌冷却至45℃后加入NNK（终浓度0.1g/L）摇匀倒平板，灭菌牙签顺序点接尼古丁降解菌于平板上，置于培养箱中于温度25~35℃下培养42~50h，筛选获得一株生长较好的菌株；
所述的筛选培养基成分以g/L计为：Na2HPO45.8~6.2，KH2PO42.8~3.2，NH4Cl0.8~1.2，NaCl0.48~0.52，MgSO40.10~0.14，CaCl20.08~0.12，尼古丁0.48~0.52，琼脂13~16；
...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢灿华，盖晓彤，马俊红，雷丽萍，姜宁，邹聪明，夏振远，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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