细菌多糖的生产制造技术

本发明专利技术尤其涉及脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)多糖的营养培养基组分、补料组分和发酵条件。本发明专利技术描述了快速、可工业规模化、成本有效的生产脑膜炎奈瑟氏球菌的方法。本发明专利技术的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。

Production of bacterial polysaccharide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌多糖的生产
本专利技术涉及一种改进的细菌多糖的生产方法。本专利技术尤其涉及生产脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)多糖的营养培养基组分、补料组分、发酵条件和纯化方法。本专利技术的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏菌通常称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性细菌，其可引起脑膜炎和其他形式的脑膜炎球菌疾病，例如脑膜炎球菌血症。根据脑膜炎奈瑟氏菌(Men)上存在的荚膜多糖的类型，已鉴定出13个血清群，在13种确定的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜类型中，有6种(A、B、C、W135、X和Y)占全球脑膜炎球菌病案件的大多数。MenA是非洲和亚洲最为流行的血清群，但在北美却很少/几乎没有。在欧洲和美国，血清群B(MenB)是引起疾病和死亡的主要原因，其次是血清群MenC和MenW。最近，在撒哈拉以南非洲地区已开始出现MenX的爆发。血清群的多样性阻碍了针对脑膜炎球菌疾病的通用疫苗的开发。由于迫切需要与这种致命疾病作斗争，1978年完成了第一种脑膜炎多糖疫苗的生产。后来发现，基于纯多糖的疫苗在两岁以下的儿童中不是很有效。这些观察结果指引了进一步的研究，研究表明婴儿的免疫系统不成熟，无法产生对纯多糖的免疫应答。免疫应答可以表征为T细胞依赖性(TD)免疫应答和T细胞非依赖性(TI)免疫应答。已知蛋白质和肽通过刺激辅助性T淋巴细胞并产生记忆细胞来诱导TD抗原。相反，多糖属于TI抗原，不会诱导T细胞活化且不形成任何记忆B细胞，这是处理婴儿时存在的主要缺点，因为它们的免疫系统不成熟。因此，需要将细菌多糖与诱导T细胞依赖性免疫应答的蛋白载体结合，其特征在于增加婴儿的免疫原性、延长保护时间和减少脑膜炎球菌的鼻咽携带。独创性的研究满足了这一需求，从而产生了多糖-蛋白结合疫苗，1999年英国批准第一批脑膜炎球菌结合疫苗。用于制备疫苗的多糖，特别是抗原性多糖可以是分别包含一种、两种或多种多糖的单价、二价和多价疫苗。这些疫苗在市场上易于获得，用于预防由多种微生物引起的某些疾病或感染。这种基于多价多糖的疫苗已经使用了很多年，并且在预防诸如肺炎球菌、脑膜炎球菌或流感嗜血杆菌等疾病方面具有重要价值。纯化的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖的生产是与载体蛋白有效结合并发展为结合疫苗的首要要求。传统上，大多数细菌发酵培养基使用动物成分来使得用于生产多糖的脑膜炎球菌生长。现需要无动物成分的培养基以在区域偏好方面提供优势，并避免传染原引发疾病，例如传染性海绵状脑病(TSE)和牛海绵状脑病(BSE)。培养用于生产荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏菌的成本通常很高，并且由于涉及一系列生产和质量控制步骤，因此涉及较长的工作时间。优化的无动物成分培养基可以避免这些问题。多糖生产步骤的改进将有利于配制有效和经济上可行的结合疫苗。有许多专利和非专利文献描述了多糖的生产和纯化方法。一篇此类文献是申请号US12/041,745的专利，其公开了一种脑膜炎球菌性脑膜炎疫苗的生产方法，该方法包括培养脑膜炎奈瑟氏菌以在脑膜炎奈瑟氏菌精制培养基(NMFM)中生产血清群A、C、Y和W-135的荚膜多糖，从培养物中分离荚膜多糖，纯化任何残留细胞生物质的荚膜多糖；然后将荚膜多糖物理解聚。引用的现有技术使用了较长时间来生产纯化的荚膜多糖。另一美国专利公开号US20150299750A1公开了用于制备脑膜炎奈瑟氏菌多糖的改进的培养、发酵和纯化条件。另一美国专利公开号20080318285A1公开了脑膜炎奈瑟氏菌精制培养基，其被设计为在较短发酵时间内使荚膜多糖的产量最大化并产生最低的细胞生物量和内毒素。本专利技术的ACFM(无动物成分的培养基)不同于ShankarPisal在美国专利公开号No.US2015/0299750和Jeerireddy在美国专利公开号US2008/0318285中所使用的培养基，以上现有技术均未使用选择性植物蛋白胨(Selectphytone)和TC酵母粉。SelectPhytoneTM是植物来源的蛋白胨。植物蛋白胨中的氮成分与天然存在的维生素相结合，有助于细菌的生长。植物蛋白胨的内毒素水平小于或等于500EU/g。TC酵母粉是肽、氨基酸、碳水化合物以及维生素的混合物。TC酵母粉产品是无动物成分的，且是自溶酵母的水溶性成分。TC酵母粉UF已在10,000MWCO(截断分子量)下进行了超滤。TC酵母粉UF的内毒素值小于500EU/g。它是一种通用的营养补品，可促进细菌生长。这是一类新的培养基组分，它替代了用于促进生长的大多数单个组分。本专利技术的培养基组分甚至不包括其他专利技术人在现有技术中使用的酪蛋白氨基酸。无动物成分培养基的最大优势是，因为由于地区偏好，中东、GCC(海湾合作委员会)国家和其他国家对ACFM疫苗(数百万剂)的需求量很大，另外此类疫苗还不含BSE和TSE。因此，目前用于生产脑膜炎奈瑟氏菌血清群的各种方法都使用动物成分培养基，且发酵方法需要相对较长的时间(高达20-24小时或更长)来培养多糖，从而增加了生产成本，并由于该方法无法以成本节约且快速的方式扩大规模且具有动物成分而使其在商业上不可行。本专利技术的目的是提供改进的营养培养基和补料培养基(feedmedia)，以通过短时间和高产量的发酵更好地生产脑膜炎奈瑟氏菌多糖。所述改进将导致以较低的价格生产多糖蛋白结合疫苗，随后可以以实惠的价格将疫苗提供给发展中国家的儿童。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种生产细菌多糖的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种生产脑膜炎奈瑟氏菌的不同血清群的荚膜多糖的方法。本专利技术的又一个目的是提供不含动物成分的优化培养基和补料培养基组分。本专利技术的又一个目的是提供用于难养脑膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W、X和Y的生长的改良营养培养基和补料培养基组分。本专利技术的又一个目的是通过简单、高效、改进和可商业规模化的方法提供在较短的时间内发酵的过程，该过程可在很短的时间内以较低的杂质获得更好的多糖产量。本专利技术的又一个目的是纯化脑膜炎奈瑟氏菌多糖，同时通过简单、高效、改进和可商业推广的方法在很短的时间内消除杂质。本专利技术的又一个目的是生产满足相关质量规格的具有更好产量的高质量产品。
技术实现思路
本专利技术描述了一种快速、可工业规模化、经济有效的使细菌优选地脑膜炎奈瑟氏菌的生长的方法以便生产细菌多糖。所述方法提供了一种以明显减少的时间纯化脑膜炎奈瑟氏菌多糖的纯化方法。本专利技术描述了脑膜炎奈瑟氏菌的营养培养基，包括但不限于浓度为1.00±0.5g/L的味精、浓度为3.25±1.0g/L的磷酸氢二钠、浓度为0.09±0.1g/L的氯化钾、浓度为10.0±2.0g/L的选择性植物蛋白胨、浓度为4.0±2.0g/L的酵母粉、浓度为5.00±2.0g/L的葡萄糖、浓度为0.03±0.1g/L的L-胱氨酸、浓度为0.60±0.5g/L的氯化镁、浓度为0.25±0.1g/L的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和浓度为1.00±0.2g/L的氯化铵。上述营养培养基组分为脑膜炎本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产血清群A、C、Y、W和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖的方法，所述方法采用改良的无动物成分的营养培养基、改良的无动物成分的补料培养基和改进的发酵过程参数，使得脑膜炎奈瑟氏菌快速生长和产量提高。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170517 IN 2017110172771.一种生产血清群A、C、Y、W和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖的方法，所述方法采用改良的无动物成分的营养培养基、改良的无动物成分的补料培养基和改进的发酵过程参数，使得脑膜炎奈瑟氏菌快速生长和产量提高。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含选自以下的两种或多种成分的组合：
-味精
-磷酸氢二钠
-氯化钾
-选择性植物蛋白胨
-TC-酵母粉
-葡萄糖
-L-胱氨酸
-氯化镁
-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
其中所述组合使得血清群A、C和X的脑膜炎奈瑟氏菌多糖快速生长和产量提高。


3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述营养培养基包含以下浓度范围的成分：





4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含以下两种或多种成分的组合：
-味精
-磷酸氢二钠
-氯化钾
-选择性植物蛋白胨
-TC-酵母粉
-葡萄糖
-L-胱氨酸
-氯化镁
-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸
-氯化铵
其中所述组合使得血清群Y和W的脑膜炎奈瑟氏菌多糖快速生长和产量提高。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述改良的无动物成分的营养培养基包含以下浓度范围的成分：





6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述改良的补料培养基包含以下两种或多种的组合：
-L-谷氨酸
-葡萄糖
-L-丝氨酸
-L-精氨酸
-甘氨酸
-L-色氨酸
-TC-酵母粉
其中所述组合使得脑膜炎奈瑟氏...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑迪普·沙玛，尼廷·库马尔，萨麦德·哈尼夫，马诺伊·库马尔·奇卡拉，达温德·吉尔，
申请(专利权)人：默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN