细菌多糖的纯化制造技术

本发明专利技术涉及脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和血清群Y多糖的快速纯化。本发明专利技术的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。

Purification of bacterial polysaccharide

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌多糖的纯化
本专利技术涉及一种改进的细菌多糖的纯化方法。本专利技术特别涉及脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)血清群W和血清群Y多糖的纯化。本专利技术的脑膜炎奈瑟氏菌多糖可用于生产经济型的抗脑膜炎球菌感染的多糖蛋白结合疫苗。
技术介绍
脑膜炎奈瑟氏菌通常称为脑膜炎球菌，是一种革兰氏阴性细菌，其可引起脑膜炎和其他形式的脑膜炎球菌疾病，例如脑膜炎球菌血症。根据脑膜炎奈瑟氏菌(Men)上存在的荚膜多糖的类型，已鉴定出13个血清群，在13种确定的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜类型中，有6种(A、B、C、W135、X和Y)占全球脑膜炎球菌病案件的大多数。MenA在非洲和亚洲最为流行，但在北美却很少/几乎没有。在欧洲和美国，血清群B(MenB)是引起疾病和死亡的主要原因，其次是血清群MenC和MenW。最近，在撒哈拉以南非洲地区已开始出现MenX的爆发。血清群的多样性阻碍了针对脑膜炎球菌疾病的通用疫苗的开发。由于迫切需要与这种致命疾病作斗争，1978年完成了第一种脑膜炎多糖疫苗的生产。后来发现，基于纯多糖的疫苗在两岁以下的儿童中不是很有效。这些观察结果指引了进一步的研究，研究表明婴儿的免疫系统不成熟，无法产生对纯多糖的免疫应答。免疫应答可以表征为T细胞依赖性(TD)免疫应答和T细胞非依赖性(TI)免疫应答。已知蛋白质和肽通过刺激辅助性T淋巴细胞并产生记忆细胞来诱导TD抗原。相反，多糖属于TI抗原，不会诱导T细胞活化且不形成任何记忆B细胞，这是婴儿存在的主要缺点，因为它们的免疫系统不成熟。<br>因此，需要将细菌多糖与诱导T细胞依赖性免疫应答的蛋白载体结合，其特征在于增加婴儿的免疫原性、延长保护时间和减少脑膜炎球菌的鼻咽携带。独创性的研究满足了这一需求，从而产生了多糖-蛋白结合疫苗，1999年英国批准了第一批脑膜炎球菌结合疫苗。用于制备疫苗的多糖，特别是抗原性多糖可以是分别包含一种、两种或多种多糖的单价、二价和多价疫苗。这些疫苗在市场上易于获得，用于预防由多种微生物引起的某些疾病或感染。这种多价多糖疫苗已经使用了很多年，并且在预防诸如肺炎球菌、脑膜炎球菌或流感嗜血杆菌等疾病方面具有重要价值。纯化的脑膜炎奈瑟氏菌荚膜多糖的生产是与载体蛋白有效结合并发展为结合疫苗的首要要求。脑膜炎奈瑟氏菌的培养和多糖的纯化的成本通常很高，并且由于涉及一系列生产和纯化步骤，因此涉及较长的工作时间。改进生产和纯化步骤将有利于配制有效和经济上可行的结合疫苗。有许多专利和非专利文献描述了多糖的生产和纯化方法。一篇此类文献是PaoloCostantino等人的US2009/0182128A1，其涉及使用CTAB和乙醇处理(50％-95％)以及使用CaCl2和碳过滤来纯化MenW、A和Y。所公开的专利申请使用多个步骤来纯化粗多糖，且纯化方法花费很长时间。另一篇申请号US12/041,745的专利公开了一种脑膜炎球菌性脑膜炎疫苗的生产方法，该方法包括培养脑膜炎奈瑟氏菌以在脑膜炎奈瑟氏菌精制培养基(NMFM)中生产血清群A、C、Y和W-135的荚膜多糖，从培养物中分离荚膜多糖，纯化任何残留细胞生物质的荚膜多糖；然后将荚膜多糖物理解聚。引用的现有技术使用了约43小时的纯化方法。通过机械方法如超声处理来实现纯化。同样，在引用的现有技术中获得的纯化荚膜多糖的产量对于MenY为43mg/L，对于MenW为47mg/L，这比本专利技术中所获得的产量低得多。目前，用于脑膜炎奈瑟氏菌血清群的多糖纯化的各种方法都需要相对长的纯化时间和复杂的方法步骤，从而增加了生产成本，并且由于该方法无法以成本节约且快速的方式扩大规模而使其在商业上不可行。本专利技术的一个目的是提供纯化脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和Y多糖的改进方法，该方法缩短时间且产量高。所述改进将导致以较低的价格生产多糖蛋白结合疫苗，随后可以以实惠的价格将疫苗提供给发展中国家的儿童。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种细菌荚膜多糖的纯化方法。本专利技术的另一个目的是提供一种脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和血清群Y多糖的纯化方法。本专利技术的又一个目的是纯化脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和血清群Y多糖，同时通过简单、高效、改进和可商业推广的方法在很短的时间内消除杂质。本专利技术的又一个目的是生产满足相关质量规格的具有更好产量的高质量产品。
技术实现思路
本专利技术描述了一种快速、可工业规模化、经济有效的生产细菌多糖优选脑膜炎奈瑟氏菌多糖的方法。所述方法提供了一种以明显减少的时间纯化脑膜炎奈瑟氏菌多糖(PS)的纯化方法。该纯化方法的大部分可以在室温下完成，整个方法不需要任何色谱步骤。本专利技术描述了用于产生高产量的脑膜炎奈瑟氏菌血清群W和Y荚膜多糖的纯化步骤。将发酵液中的粗多糖用MilliQ水(MQW)进行浓缩和渗滤，以形成降低杂质水平的浓缩物。将如此得到的浓缩物在预定温度下用碱例如1±0.2M的NaOH处理最佳时间。将所得的部分纯化的多糖再次用MQW进行渗滤，然后进行碳过滤，最后进行无菌过滤。因此，使用可规模化、具有成本效益的和高效的方法可以在明显减少的时间内回收纯化的多糖。本专利技术的方法可用于纯化脑膜炎球菌多糖。与现有技术相比，该方法具有许多优点，例如提供了一种稳健且快速的纯化多糖的方法，该方法能够满足所需规格并且产量高。另一个优点是该方法是完全可规模化的。附图说明图1描述了MenW和MenY多糖纯化的工艺流程图2(a)和(b)分别描述了MenW和MenY多糖的HPLC色谱图图3(a)和(b)分别描述了MenW和MenY多糖的NMR谱图图4描述了标准MenW多糖组和纯化的MenW多糖组针对抗MenW多克隆抗体的抑制百分比具体实施方式本专利技术公开了能够在更少的时间内纯化MenW和MenY多糖的优化步骤，如图1所示。用100KDa(0.1m2)聚醚砜(PES)膜对MenW和MenY多糖的发酵液进行浓缩和渗滤。用碱处理所得MenW和MenY浓缩物。更优选地，用1±0.2MNaOH在75±5℃的温度范围内处理MenW和MenY浓缩物2±0.5小时，优选2小时。将所得部分纯化的多糖冷却至室温。冷却后，通过100kDaPES膜对用20±2体积MQW部分纯化的多糖进行浓缩和渗滤。进行浓缩和渗滤的步骤用以除去NaOH。浓缩和分离的步骤之后是用默克(Millistak)碳过滤器进行碳过滤，如默克即用型深度过滤器(PodDepthFilters)，0.027m2或更高规格，直到部分纯化的多糖达到≤0.2的光密度。再次用100KDaPES膜对所得滤液进行浓缩，并用0.2μmPES组件进行无菌过滤，得到纯化的MenW和MenY多糖。将所得纯化的多糖在-20±2℃下保存待用。纯化的多糖符合各种所需规格，发酵物对于MenW和MenY的产量分别高达174mg/L和405mg/L。本专利技术的实施例1至3详述了实施本专利技术的方法。实施例1和2中使用的方法导致多糖(PS)不满足中间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脑膜炎奈瑟氏菌血清群W(MenW)和血清群Y(MenY)的荚膜多糖的纯化方法，其中所述纯化方法包括以下步骤：/n(a)将发酵液进行浓缩和渗滤；/n(b)将步骤(a)的浓缩和渗滤的浓缩液在高温下进行碱处理，得到部分纯化的多糖；/n(c)将步骤(b)的部分纯化的多糖进行浓缩和渗滤，并进行碳过滤，获得滤液；/n(d)将步骤(c)得到的滤液进行无菌过滤，得到纯化的MenW或MenY的多糖；/n其中所述纯化方法在7±1小时内迅速完成。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170517 IN 201711017277;20180405 IN 2018120130411.一种脑膜炎奈瑟氏菌血清群W(MenW)和血清群Y(MenY)的荚膜多糖的纯化方法，其中所述纯化方法包括以下步骤：
(a)将发酵液进行浓缩和渗滤；
(b)将步骤(a)的浓缩和渗滤的浓缩液在高温下进行碱处理，得到部分纯化的多糖；
(c)将步骤(b)的部分纯化的多糖进行浓缩和渗滤，并进行碳过滤，获得滤液；
(d)将步骤(c)得到的滤液进行无菌过滤，得到纯化的MenW或MenY的多糖；
其中所述纯化方法在7±1小时内迅速完成。


2.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述步骤(a)的浓缩和渗滤用100KDaPES膜进行。


3.根据权利要求1所述的纯化方法，其中，所述步骤(b)的碱处理在75±5℃下用1±0.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑迪普·沙玛，尼廷·库马尔，萨麦德·哈尼夫，马诺伊·库马尔·奇卡拉，达温德·吉尔，
申请(专利权)人：默沙东和惠康基金会合资的希勒曼实验室私人有限公司，
类型：发明
国别省市：印度;IN