一种猫艾滋病毒重组蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猫艾滋病毒重组蛋白及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域，包括猫艾滋病毒抗原和猫艾滋病毒单链抗体；包括以下步骤:(1)查找猫艾滋病毒中含有主要抗原决定簇的p24抗原；(2)优化猫艾滋病毒p24抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；(3)构建针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；(4)重组优化的猫艾滋病毒p24抗原基因和针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；(5)纯化及复性猫艾滋病毒重组蛋白。本发明专利技术在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体，易于在细胞中表达，可在真核或者原核细胞中表达，可大量生产，成本较低。

A feline HIV recombinant protein and its preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
一种猫艾滋病毒重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域,具体涉及一种猫艾滋病毒重组蛋白。
技术介绍
猫艾滋病毒(FelineImmunodeficiencyVirus,FIV)是一种由病毒感染引起的免疫缺陷疾病，他和人类的爱滋病非常相似，所以也被称为猫的爱滋病。因为临床症状无特殊专一性，偶尔可见，齿龈炎、口腔炎、厌食、青光眼、拉肚子、消瘦；加上血液学偶尔才可见贫血、低淋巴球血症及低嗜中性球血症，所以目前诊断有其困难性，现今大多借助实验室诊断，以测试FIV的抗体来做为诊断依据。体外诊断核心原料的开发是开发相应诊断试剂的前提,只有开发出具有高活性、高性能的抗原抗体,体外诊断试剂产品才能成为现实。因此,针对猫艾滋病毒抗体和抗原开发出能够用以生产诊断试剂的原料迫在眉睫,从某种程度上说,原料的开发也必将成为降低猫艾滋病毒病蔓延的首要解决问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种猫艾滋病毒重组蛋白,所述重组蛋白包括猫艾滋病毒抗原和猫艾滋病毒单链抗体。进一步地,本专利技术所述猫艾滋病毒抗原为含有主要抗原决定簇的p24抗原,所述猫艾滋病毒单链抗体为scFv。本专利技术还提供了一种猫艾滋病毒重组蛋白的制备方法,其制备步骤如下：(1)查找猫艾滋病毒中含有主要抗原决定簇的p24抗原从NCBI(美国国立生物技术信息中心)中查找到猫艾滋病毒含有主要抗原决定簇的p24抗原。(2)优化猫艾滋病毒p24抗原基因的密码子,合成核酸序列并进行表达在大肠杆菌中表达蛋白时,不同密码子使用的频率有较大区别,为了使重组蛋白的表达量达到最大,需将猫艾滋病毒p24抗原基因序列进行密码子优化,然后合成优化后的核酸序列并进行表达。(3)构建针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体,调取单链抗体scFv的基因将纯化之后的p24抗原蛋白免疫小鼠获得高活性单克隆抗体,再调取单链抗体scFv基因。(4)重组优化的猫艾滋病毒p24抗原基因和针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体scFv基因,并进行表达将优化后的猫艾滋病毒p24抗原基因(16-213aa)和针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体scFv基因(能够针对结合p24抗原蛋白的1-15aa部分)通过递归PCR技术连接起来,测序分析序列正确后,把重组蛋白的基因片段插入到表达载体上进行表达。(5)纯化及复性猫艾滋病毒重组蛋白。本专利技术的表达系统为大肠杆菌表达系统,它具有周期短,费用低,表达量大等特点。为了使得重组蛋白更好地保持活性位点,本专利技术选择比较温和的培养和诱导条件,其表达时的诱导温度为20℃、25℃、28℃、37℃,进一步优选的诱导温度为25℃、37℃,更进一步优选的诱导温度为25℃。诱导转速为250rpm,诱导的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为0.1mM。这样使得重组蛋白有了更加缓慢的表达,有充分的时间进行空间构象的形成。本专利技术可以采用超声的方式破碎细菌。在破碎菌体的时候,为了避免剧烈条件,将破碎条件定为200w,每次超声6s,间隔3s超声一次,共180次。本专利技术重组蛋白的纯化方式有离子交换层析,凝胶过滤层析和亲和层析等方法,进一步优选为亲和层析。本专利技术在重组蛋白中加入了6XHis标签,使亲和层析纯化方式能够达到较高的纯度。本专利技术的重组蛋白利用基因工程重组技术,在大肠杆菌系统中表达猫艾滋病毒抗原和单链抗体的重组蛋白方法,具有生产周期短、产量高、成本低等优点。本专利技术的猫艾滋病毒重组蛋白可做为猫艾滋病毒免疫诊断试剂盒的一部分。本专利技术具有以下优点及有益效果：(1)首次开发针对猫艾滋病毒主要抗原p24的单链抗体scFv。本专利技术在开发单克隆抗体的基础上又进行重组抗体技术开发单链抗体,单链抗体具有以下优点：1)具有完整的抗原结合位点,不含抗体恒定区；2)分子量小,减少了抗体的非特异性结合,降低了诊断产品的假阳性风险；3)结构简单,易于基因工程改造；4)易于在细胞中表达,可以在真核或者原核细胞中表达,可大量生产,成本较低。(2)国内外首次开发猫艾滋病毒主要抗原表位及针对p24抗原的scFv重组蛋白。由于感染猫艾滋病毒初期不产生抗体,致使在此段时间我们检测不到相应的猫艾滋病毒抗体,从而导致漏检,为了解决此问题必须在检测猫艾滋病毒抗体的同时增加对抗原的检测,开发针对猫艾滋病毒p24抗原的抗体成为关键。(3)制备了同时结合猫艾滋病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白。在主要抗原表位和针对猫艾滋病毒p24抗原的抗体开发出后,利用基因工程技术将筛选出的高效抗原表位(猫艾滋病毒p24抗原的16-213aa)和针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体scFv(1-15aa)重组,制备成具有同时结合猫艾滋病毒抗体和抗原的高活性、高灵敏度和高特异性的重组蛋白,该重组蛋白具有以下优点：1)在快诊试剂条中只需要使用一种原料即可,这样可以避免多种原料间的交叉反应；2)在原料的生产上,只需要稳定一种原料的生产工艺即可,这样可以减少生产成本的投入,缩短原料生产周期,降低生产批间差；3)节省了开发猫艾滋病毒诊断试剂的成本。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步说明,但并不将本专利技术局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到,本专利技术涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案、改进方案和等效方案。实施例1猫艾滋病毒p24抗原基因的密码子优化及表达载体构建从NCBI查找p24抗原基因PDB:5NA2_A,其16-213aa蛋白质序列如下：PKMVSIFMEKAREGLGGEEVQLWFTAFSANLTPTDMATLIMAAPGCAADKEILDESLKQLTAEYDRTHPPDAPRPLPYFTAAEIMGIGLTQEQQAEARFAPARMQCRAWYLEALGKLAAIKAKSPRAVQLRQGAKEDYSSFIDRLFAQIDQEQNTAEVKLYLKQSLSIANANADCKKAMSHLKPESTLEEKLRACQEI经过密码子优化后序列如下：CCGAAAATGGTGTCCATTTTTATGGAAAAAGCGCGTGAAGGCCTGGGCGGCGAAGAAGTGCAGCTGTGGTTTACCGCGTTTTCCGCGAATCTGACCCCGACCGATATGGCGACCCTGATTATGGCGGCGCCGGGCTGCGCGGCGGATAAAGAAATTCTGGATGAATCCCTGAAACAGCTGACCGCGGAATATGATCGTACCCATCCGCCGGATGCGCCGCGTCCGCTGCCGTATTTTACCGCGGCGGAAATTATGGGCATTGGCCTGACCCAGGAACAGCAGGCGGAAGCGCGTTTTGCGCCGGCGCGTATGCAGTGCCGTGCGTGGTATCTGGAAGCGCTGGGCAAACTGGCGGCGATTAAAGCGAAATCCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猫艾滋病毒重组蛋白，其特征在于:包括猫艾滋病毒抗原和猫艾滋病毒单链抗体:/n所述猫艾滋病毒抗原为含有主要抗原决定簇的p24抗原；/n所述猫艾滋病毒单链抗体为scFv。/n

【技术特征摘要】
20181226 CN 20181160296711.一种猫艾滋病毒重组蛋白，其特征在于:包括猫艾滋病毒抗原和猫艾滋病毒单链抗体:
所述猫艾滋病毒抗原为含有主要抗原决定簇的p24抗原；
所述猫艾滋病毒单链抗体为scFv。


2.一种基于权利要求1所述的一种猫艾滋病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:包括以下步骤:
(1)查找猫艾滋病毒中含有主要抗原决定簇的p24抗原；
(2)优化猫艾滋病毒p24抗原基因的密码子，合成核酸序列并进行表达；
(3)构建针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体，调取单链抗体scFv的基因；
(4)重组优化的猫艾滋病毒p24抗原基因和针对猫艾滋病毒p24抗原的单链抗体scFv的基因，并进行表达；
(5)纯化及复性猫艾滋病毒重组蛋白。


3.根据权利要求2所述的一种猫艾滋病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)和步骤(4)在大肠杆菌系统中表达。

【专利技术属性】
技术研发人员：李晓光，刘毅，王哲侃，徐玉霞，
申请(专利权)人：杭州爱谨生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33