一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法技术

本发明专利技术提供了一种禽传染性支气管炎QX型野毒株与疫苗毒株的鉴别引物和鉴别方法，本发明专利技术利用禽传染性支气管炎QX型野毒与疫苗毒的序列差异，筛选出特异性的4条引物序列，建立鉴别QX型禽传染性支气管炎野毒和疫苗毒的双重RT‑PCR方法。本发明专利技术所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、客观公正、经济实用的特点。

A method to distinguish wild virus and vaccine virus of avian infectious bronchitis QX virus

【技术实现步骤摘要】
一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法。
技术介绍
传染性支气管炎(InfectiousbronchitisIB)是由传染性支气管炎病毒(InfectiousbronchitisvirusIBV)引起鸡的一种急性、高度接触性的病毒性传染病，是当前危害养禽业最为严重的病毒性传染病之一。IBV的血清型很多，而且新的血清型和变异株仍在不断出现,近年来QX型的IBV在我国鸡群中广泛流行，成为主要的流行毒株,为有效预防和控制该病的流行，鸡群免疫QX型疫苗，但是由于IBV血清型众多，而且无论是在免疫鸡群还是非免疫鸡群中，均可以检测到IBV毒株的流行，对于QX型野毒和疫苗毒感染缺乏有效的鉴别诊断方法。目前国内外均没有可以鉴别诊断QX型疫苗株和野毒株感染的方法，难以对鸡群感染IBV基因型情况进行鉴定检测，这已成为目前影响动物防疫的一大难题，急需解决。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种禽传染性支气管炎QX型病毒野毒与疫苗毒的鉴别方法，以及使用的引物组，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供用于区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段，以及区别于其他IBV，QX型IBV通用的分子片段。通过测得QX型疫苗型病毒株基因组全长序列以及目前流行的QX型野生型病毒株序列与GenBank上其他基因型IBV进行比对分析，找到禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株有差异的分子片段；通过GenBank中其他基因型IBV序列与QX型IBV序列比对分析，找到QX型IBV通用的分子片段，其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQIDNO:1；禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQIDNO:2；禽传染性支气管炎QX型病毒通用的分子片段：SEQIDNO:3；本专利技术还提供一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的的制品，所述的制品用于检测上述的分子标记；所述的制品，优选为PCR扩增检测试剂盒或测序试剂盒。本专利技术还提供用于区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的引物对，所述的引物对用于检测上述区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段；其中一种具体的引物对的序列如下：针对QX疫苗毒的上游引物：YM-F:ATACCGCCACCTGATGTTGT(SEQIDNO:4)、针对QX疫苗毒的下游引物：YM-R:TTTGAGCGTGTTCCTGTTGAC(SEQIDNO:5)、针对QX型IBV的上游引物：YD-F:AGTAGTGGTAGCGGGTCTTG(SEQIDNO:6)、针对QX型IBV的上游引物：YD-R:ACACACCTGCTGACGTAAC(SEQIDNO:7)。本专利技术还提供一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的方法，是通过上述的引物组来进行PCR扩增检测。本专利技术通过测得QX疫苗毒基因组序列以及大量目前流行的QX野毒序列，与GenBank中其他基因型IBV序列比对分析，筛选出能够区分QX疫苗毒和野毒的鉴别引物，并建立了相应的PCR鉴别方法。本专利技术所述鉴别方法无需依赖深厚的专业背景，也无需借助昂贵的精密仪器，具有准确快捷、经济实用的特点。附图说明图1：本专利技术中QX型IBV疫苗毒和野毒两对引物双重RT-PCR扩增结果图。图2、图3是本专利技术中临床样品利用两对引物双重RT-PCR扩增结果。具体实施方式本专利技术提供了一种IBV的QX型野毒与疫苗毒的鉴别引物和鉴别方法通过测得QX疫苗毒基因组序列以及大量目前流行的QX野毒序列，与GenBank中其他基因型IBV序列比对分析，获得QX疫苗毒和野毒基因组序列的差异分子片段以及QX型IBV通用分子片段，为了检测差异分子片段，设计筛选出2对特异性的能够区分QX疫苗毒和野毒的鉴别引物；并利用上述鉴别引物建立了相应的PCR鉴别方法，依据特异性的PCR扩增结果判断鸡群感染毒株种类，从而达到鉴别QX疫苗株和野毒株感染的目的。下面结合附图和实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细的描述。实施例1：QX型IBV疫苗毒和野毒株差异片段的筛选和检测引物设计通过对QX型IBV疫苗毒、目前流行的QX野毒株、以及GenBank上其他基因型的IBV序列比对发现，与QX型疫苗株相比，其他基因型的IBV以及QX型野毒株，在IBV1a基因上均有4个碱基的插入，根据此处差异设计引物，扩增QX型IBV疫苗毒株序列。其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQIDNO:1；禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQIDNO:2。所述引物序列为：针对QX疫苗毒的上游引物：YM-F:ATACCGCCACCTGATGTTGT针对QX疫苗毒的下游引物：YM-R:TTTGAGCGTGTTCCTGTTGAC通过对GenBank中其他基因型IBV序列比对，发现不同基因型的IBV在S1基因差异较大，根据各基因型IBVS1序列比对结果，筛选出QX型IBV特有的分子片段，并在该处设计引物，扩增QX型IBV。所述禽传染性支气管炎QX型通用分子片段为SEQIDNO:3。所述引物序列为：针对QX型IBV的上游引物：YD-F:AGTAGTGGTAGCGGGTCTTG针对QX型IBV的下游引物：YD-R:ACACACCTGCTGACGTAAC。本专利技术还提供了利用上述鉴别引物的QX野毒和疫苗毒的鉴别方法。利用所述引物和鉴别方法鉴别临床样本QX野毒和疫苗毒感染情况。参照天恩泽RNA提取试剂盒说明书提取所述样品的RNA。取病毒液200μL，加1000μL溶液A，混匀；加200μL氯仿溶液，震荡混匀，12000rpm，4℃离心10min；小心吸取水相600μL加入到新的DEPC处理过的1.5mL离心管中，加等体积的溶液B混匀，分两次加到离心吸附柱中，12000rpm，离心30s，弃穿透液，加700ul洗液，12000rpm，离心30s，弃穿透液，12000rpm，空离30s。将离心柱转移新的DEPC处理过的1.5mL离心管中，加60ul洗脱液，12000rpm，离心30s，得到RNA-20℃保存备用。利用本专利技术中提供的4种引物，TAKARAPrimeScript1StepEnzyme对其RNA进行一步法RT-PCR扩增。PCR反应体系为25μL，各种成分及使用量为PrimeScript1StepEnzymeMix1μL、2×1StepBuffer12.5μL、4条引物(20μM)0.5μL、样品RNA50ng，用双蒸水补齐到25μL。PCR反应程序是50℃30min，94℃3min(94℃30sec→55℃35sec→72℃1min)×32个循环→72本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段，其特征在于，所述的分子片段，/n其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:1，/n禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQ ID NO:2，/n禽传染性支气管炎QX型病毒通用的分子片段：SEQ ID NO:3。/n

【技术特征摘要】
1.一种区别禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的分子片段，其特征在于，所述的分子片段，
其中禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株的分子片段为SEQIDNO:1，
禽传染性支气管炎QX型病毒疫苗型病毒株的分子片段为SEQIDNO:2，
禽传染性支气管炎QX型病毒通用的分子片段：SEQIDNO:3。


2.一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株的制品，其特征在于，所述的制品用于检测权利要求1所述的分子片段。


3.如权利要求2所述的制品，其特征在于，所述的制品为PCR扩增检测试剂盒或测序试剂盒。


4.一种用于检测禽传染性支气管炎QX型病毒野生型病毒株与疫苗型病毒株...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋姗姗，刘东，刘红祥，李彬，王群义，张翔，刘丰波，任衍倍，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37