非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂，本发明专利技术建立基于ASFV p17蛋白的编码基因D177L的TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，通过条件优化得到较为理想的扩增曲线和检测效果，与传统PCR检测方法相比，具有特异性更强、灵敏度更高、重复性更好、自动化程度更高反应更快等优点，且不需要电泳及紫外检测耗时更短、结果更加直观。

TaqMan real-time fluorescent quantitative PCR detection primer and kit for African swine fever

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测引物及试剂盒
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是一种以非洲猪瘟基因片段为靶目标设计的生物制剂，使用实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)技术检测非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)中D177L基因的方法，即非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途。
技术介绍
非洲猪瘟(Africanswinefever,ASF)由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus,ASFV)引起病毒性疾病。ASFV是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科，也是唯一虫媒DNA病毒。ASF临床上以高热，内部器官广泛出血，脾肿大且颜色呈黑色为主要特征，是影响养猪业的最严重的病毒性疾病之一，被世界动物卫生组织(OIE)列为“应报告的疾病”。目前还没有有效的疫苗来预防ASF，因此，它对养猪业和全球食物安全构成了重大威胁。由于ASF的临床症状很难与古典猪瘟(Classicalswinefever,CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)区分开，需通过血清学检测以及病毒分离鉴定来确诊。自2018年8月我国辽宁省沈阳市沈北新区上报了第一例非洲猪瘟疫情以后，非洲猪瘟疫情在我国迅速蔓延开来，给我国养猪业造成了迄今最为惨重的经济损失，严重威胁着我国养猪业的发展。目前国际上尚未开发出安全有效的疫苗用于ASF的防控。因此，迫切需要建立病毒的快速诊断方法，以帮助我们了解和控制中国非洲猪瘟疫情，同时为后续对ASFV的深入研究提供方便。ASFV的D177L基因可编码p17蛋白,这是ASFV表达的晚期膜蛋白，核苷酸序列为354nt，编码蛋白大小为13.1kD。是位于病毒内膜的蛋白。有研究表明，p17对于病毒活力至关重要，能促进ASF病毒的二十面体颗粒形成。若缺失p17蛋白，组装后的病毒将不稳定，失去感染作用。P17蛋白还同时具有抑制蛋白水解的作用，使多聚蛋白pp220和pp62不能进一步水解。因此p17蛋白的编码基因D117L是ASFV研究的重要基因之一。据报道，ASFV接触感染的潜伏期为4~19d，出现临床症状的2d前感染动物就开始散播病毒，感染后的7~9d血清转阳。据此可说明，ASF的早期诊断抗原检测技术要优于抗体检测技术。荧光定量检测法作为一种特异、灵敏、快速的检测方法，是应用于ASF早期检测的一种必不可少的检测手段。本研究将建立一种高特异性、灵敏性的ASFVTaqMan荧光定量检测方法，以应用于今后ASF的早期检疫检测。由于非洲猪瘟疫情从2018年才在国内爆发，且国家对非洲猪瘟样品检测有所限制，前学者建立的荧光定量检测方法应用大多还停留在实验室阶段，同时，检测的灵敏性较低，一般为数十拷贝，而且存在假阳性等问题。本研究所已获得非洲猪瘟检测资质授权，可对非洲猪瘟阳性样品进行检测，更有力的说明本研究建立ASFVTaqMan荧光定量检测方法可应用于临床检测。
技术实现思路
本研究建立了一种基于ASFVp17蛋白的编码基因D177L的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法仅特异性扩增ASFV，不与CSFV、PRRSV、PEDV、PRV等发生交叉反应，特异性较高。本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种检测非洲猪瘟D177L基因的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂及其制备方法和用途。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标长度为134bp，引物和探针序列为：上游引物：5’-TCGAGCATACCTAAACCTC-3’，下游引物为5’-GCTAATTGTTCGTCGCTT-3’，探针序列为5’FAM-CACCTCCCTGCAGTCCCA-3’BHQ1，所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂的制备方法，包括以下步骤：(1)选择非洲猪瘟病毒的D177L基因序列保守片段为靶目标；(2)根据D177L基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；(3)探针的合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；(4)设计特异性的非洲猪瘟病毒的D177L基因PCR扩增引物；(5)经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件、引物及探针的特异性和灵敏度。所述(5)中的反应最佳条件为确定实时荧光定量PCR反应体系为：ProbeqPCRMix（2×）10μl，探针0.4μl，上游引物、下游引物（10μM）各0.6μl，DNA1μl，用ddH2O补齐20μl，荧光定量PCR反应的循环条件是：95℃1min，95℃5s，59℃60s，40个循环。所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在检测非洲猪瘟病毒方面及生产标准化试剂盒中的应用。所述的非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂在绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途。所述的绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线的用途，绘制非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测标准曲线包括以下步骤：(1)重组质粒pUC57-ASFV-D177L的定量，并换算成拷贝数；(2)重组质粒pUC57-ASFV-D177L的梯度稀释；(3)以所述的引物及探针对各浓度梯度重组质粒pUC57-ASFV-D177L进行实时荧光PCR检测，记录数据生成标准曲线。本专利技术的有益效果是：该方法的最低检测数为个位数的拷贝，与王建华等建立的基于ASFVCP530R基因TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法最低可检测到61个拷贝的质粒以及张泉等基于ASFVB646L基因Real-timePCR最低检测出20个病毒核酸分子结果相比较更为灵敏；本专利技术的实时荧光定量PCR检测方法敏感性试验最低检测量为<10个拷贝，具有较高的灵敏性。组间与组内的重复性试验变异系数均小于1.9207%，实验结果表明该方法具有良好的重复性。通过对临床样品检测可见，本研究建立的TaqMan实时荧光定量检测方法可有效的检测出阴性核酸样品。样品核酸抽提以及荧光定量PCR检测最快可在2小时完成。附图说明图1是引物对合成的质粒进行PCR鉴定电泳图，其中，1.DNA标准DL2000；2.阳性质粒；3.阴性对照；图2是ASFVD177L阳性标准质粒扩增曲线，其中，1-7表示.1×108-1×102拷贝/μL图3中ASFVD177L基因TaqMan实时荧光定量PCR敏感性试验扩增曲线，其中1-8表示.1×108-1×101拷贝/μL；9.阴性对照图4ASFVD177L基因TaqMan实时荧光定量PCR敏感性试验标准曲线图5以CSFV、PRRSV、PEDV、P本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标长度为134bp，引物和探针序列为：/n上游引物：5’-TCGAGCATACCTAAACCTC-3’，/n下游引物为5’-GCTAATTGTTCGTCGCTT-3’，/n探针序列为5’FAM-CACCTCCCTGCAGTCCCA-3’BHQ1。/n

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂，包含一对特异性引物和一条特异性探针，扩增目标长度为134bp，引物和探针序列为：
上游引物：5’-TCGAGCATACCTAAACCTC-3’，
下游引物为5’-GCTAATTGTTCGTCGCTT-3’，
探针序列为5’FAM-CACCTCCCTGCAGTCCCA-3’BHQ1。


2.权利要求1所述的非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂的应用，所述应用为将其制备成试剂盒，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择非洲猪瘟病毒的D177L基因序列保守片段为靶目标；
(2)根据D177L基因特点和引物、探针设计原则，设计引物和探针；
(3)探针的合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ1；
(4)设计特异性的非洲猪瘟病毒的D177L基因PCR扩增引物；
(5)经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，确定反应最佳条件、引物及探针的特异性和灵敏度。


3.根据权利要求2所述的的应用，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高飞，童光志，杜楠楠，郑浩，童武，李国新，姜一峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所中国动物卫生与流行病学中心上海分中心，
类型：发明
国别省市：上海;31