SIV和PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物制造技术

本发明专利技术公开了H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT‑PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。据此，发明专利技术人还研制了相应的快速检测方法及其试剂盒，对重组质粒标准品的检出量可低至9.86×10

Multiple RT-PCR kits and primers for rapid detection of SIV and PRRSV

【技术实现步骤摘要】
SIV和PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物
本专利技术属于猪呼吸道病毒核酸检测
，尤其涉及H1、H3亚型SIV(猪流感病毒)和美洲型、欧洲型PRRSV(猪繁殖与呼吸综合征病毒)多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物。
技术介绍
养猪业已经成为我国农业领域较为重要的支柱性产业，近年来，伴随着饲养方式朝往集约化、规模化的方向转变，猪群当中发生多种病原混合感染的情况愈演愈烈。特别是某些种类的猪病所引发的病理变化和临床症状不够典型，甚至在流行病学上也存在着相似性，这就使得我们在日常工作中很难凭借主观感受去区分这类疾病，更无法直观地确诊发病猪群同时感染了这些病原体。猪流感(SwineInfluenza，SI)是由猪流感病毒(SwineInfluenzaVirus，SIV)引起的一种急性、热性、高度接触性的呼吸道传染病，通常在猪场内呈现大规模的暴发或者地方性的流行，临床上多以突发性、群发性、咳嗽、呼吸困难为主要特征。目前，世界范围内流行的SIVs主要包括H1N1，H1N2和H3N2三种不同亚型。不同年龄、性别和品种的猪均能够感染SIV，猪群感染率高达100％，死亡率却非常低。尽管如此，猪作为异源毒株间发生基因重组的“混合容器”，其呼吸道上皮同时存在人源和禽源两种唾液酸受体，能够重配出具备感染人潜力的新型流感病毒，这对人类健康构成了巨大的威胁。猪繁殖与呼吸综合征，又叫做“猪蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起猪繁殖和呼吸障碍的一类传染病，临床症状多为厌食、发热、怀孕后期发生流产，产死胎和木乃伊胎；幼龄仔猪发生呼吸系统疾病且大量死亡。该病最早于1987年在美国发生，现在已经呈现世界性分布。我国是于1996年首次分离到PRRSV美洲型的经典株，2006年分离到PRRSV美洲型高致病性变异毒株。2010年分离并鉴定出致病性的PRRSV欧洲型毒株。在我国，PPRSV流行毒株主要以美洲型的经典株和高致病性变异株为主，但是近些年，已有大量报道证实，我国部分省份的欧洲型PRRSV阳性检出率开始出现上升态势。SIV属于正黏病毒科，是一种分节段的单股负链RNA病毒；PRRSV属于动脉炎病毒科，是一种单股正链RNA病毒。猪流感病毒(SIV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)同为“猪呼吸道疾病综合征”(PorcineRespiratoryDiseaseComplex，PRDC)的两大类原发病原，均属于免疫抑制性疾病，可以破坏猪的免疫系统而引起免疫抑制，导致其他疫病并发或继发感染，加剧病情，给养猪业造成重大的经济损失，严重制约了我国生猪养殖产业健康的发展。猪群中流行的流感病毒绝大多数为H1或H3亚型，流行的蓝耳病毒为美洲型(NorthAmerica，NA)或欧洲型(Europe，EU)，目前针对这些病毒的研究成果主要包括：猪H1、H3亚型流感病毒或者猪繁殖与呼吸综合征的分型方法以及同时检测和鉴别北美型猪繁殖与呼吸综合征病毒、欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。然而，尚未有人建立过针对这四类病毒的四重RT-PCR快速简便的诊断方法。多重PCR方法(MultiplexPCR，M-PCR)是基于普通PCR方法开发出来的一种更加高效的病原鉴定方法，多重PCR方法只需利用一次PCR反应，就可以同时检测、鉴别出多种病原体。通常来说，与电镜观察、病毒分离、免疫组织化学、ELISA血清学检测、荧光抗体技术等常用的诊断手段相比，多重PCR检测方法降低了操作难度，减少了操作时间、劳动力和成本，提高了检测效率，不失为一种方便实用的疫病混合感染快速诊断方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供简单、高效、灵敏的H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒及引物，以实现快速诊断这些病毒，便于尽快采取有效防控措施，减少这些疾病对养猪业造成的危害，提升公共卫生安全。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。引物1至引物8的初始浓度摩尔比为3:3:3:3:5:5:3:3。上述引物在制备H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。该试剂盒主要由PCR标准品、阳性对照品、阴性对照品和PCR引物组成，四对PCR引物中所有上游引物同管包装，所有下游引物同管包装。PCR标准品包括H1-SIV标准品、H3-SIV标准品、NA-PRRSV标准品、EU-PRRSV标准品；阳性对照品是含H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种病毒的阳性质粒混合物；阴性对照品是灭菌后的去离子水。PCR标准品均为扩繁所得的阳性细胞毒。四种病毒的阳性质粒混合物的浓度为9.86×109copies/μL。四对PCR引物的体系终浓度占比为3:3:3:3:5:5:3:3。针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV四种类型病毒存在交叉感染、混合感染且难以区分的问题，专利技术人运用多重RT-PCR技术，针对性地设计了H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。据此，专利技术人还研制了相应的快速检测方法及其试剂盒，对重组质粒标准品的检出量可低至9.86×100copies/μL。临床检测结果表明，应用本专利技术可在同一反应管内同时检测区分H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV、EU-PRRSV这四种类型病毒的单个或混合感染，具有特异性高，敏感性好，耗时短且成本低的特点。本专利技术为猪群混合感染的检测提供了快速简便的工具，为临床快速鉴别检测及实验室流行病学调查奠定坚实的基础，有利于养猪业及时制定疾病防控方案，减少猪群死亡率和经济损失。附图说明图1是本专利技术四重RT-PCR检测方法建立的电泳图，图中：M:DL2000DNAMarker；1、2、3、4泳道分别对应用H1-SIV、H3-SIV、NA-PRR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，其特征在于包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；所述四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。/n

【技术特征摘要】
1.H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测引物，其特征在于包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；所述四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。


2.根据权利要求1所述的多重RT-PCR快速检测引物，其特征在于所述引物1至引物8的初始浓度摩尔比为3:3:3:3:5:5:3:3。


3.权利要求1所述引物在制备H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒中的应用。


4.H1、H3亚型SIV和美洲型、欧洲型PRRSV多重RT-PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括四对PCR引物，它们分别针对H1-SIV、H3-SIV、NA-PRRSV和EU-PRRSV四种类型病毒；所述四对PCR引物为引物1至引物8，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.8的碱基序列。


5.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈樱，余良政，韦祖樟，王豪，林霜，任同伟，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45