一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法技术

本发明专利技术提供了一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法，包括如下步骤：制备猪瘟病毒C株的病毒液，灭活，得到灭活的病毒液；然后将灭活的病毒液和保护剂混合，冻干，得到猪瘟病毒核酸标准物质。其检测方法以推进猪瘟病毒核酸分子检测标准化及我国猪瘟病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。猪瘟病毒核酸标准物质不仅可为兽医实验室开展量值溯源、能力验证、质量控制、方法评价、试剂选择等工作提供技术支撑，还能提高全国不同类型兽医检测实验室的检测能力和技术水平，更为动物疫病净化和畜产品质量安全评价、身份验证、国内监管、进出口检验、企业自控和国际贸易互认提供有力保障。

Preparation and detection of nucleic acid reference material of freeze-dried classical swine fever virus

【技术实现步骤摘要】
一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法及其检测方法，猪瘟病毒核酸标准物质即猪瘟病毒核酸标准样品。
技术介绍
猪瘟(classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(classicalswinefevervirus,CSFV)感染引起的一种高致死性的烈性传染病，以接触性传染，急性呈败血性变化，实质器官出血、坏死和梗死，慢性呈纤维素性坏死性肠炎为主要特征。是严重威胁养猪业的传染病之一，被世界动物卫生组织(officeinternationaldesepizooties,OIE)列入OIE疫病名目，也是我国农业农村部规定的一类传染病。本病在世界各地相继发生，其中以欧洲和亚洲最为严重，近年来我国流行的猪瘟以非典型性临床症状和病理剖检为主，其病原属黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，其RNA为单股正链，病毒粒子呈圆形，大小为38～44nm，核衣壳是立体对称二十面体，氯化铯中浮密度1.15～1.17g/ml，有包膜，该病毒对乙醚敏感，对温度、紫外线、化学消毒剂等抵抗力较强。当前国内外针对猪瘟病毒的检测试剂盒研究是百花齐放，兽医检测实验室在选择方面偏重于血清检测试剂盒以进口为主，核酸检测试剂盒以国产为主，但是，国内针对这些检测方法的标准物质却十分匮乏，各级检测机构缺少阳性血清、抗原、核酸标准物质。尽管各有关科研单位或多或少拥有一部分类似材料，但往往其来源背景不清、制备工艺不完善、没有经过标定，仍达不到国家级标准物质的要求。自上世纪90年代以来，动物及动物产品质量安全已成为全世界关注的焦点。美国、欧盟等发达国家早在70年代就全面开展了动物产品质量检测工作，并形成了一整套质量评价程序和控制体系，有关标准物质的研究开发工作也处于领先地位，并逐渐系统化。我国80年代以来也开始研制临床检验标准物质，主要是以血、尿、发为机体的提供无机成分和微量元素标准值的分析标准物质和纯品试剂标准物质。90年代以来，我国逐步建立了动物疫病和动物产品质量安全检测体系，陆续发布了一系列动物疫病检测标准，但是与之配套的检测标准物质研究与开发严重滞后。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种冻干型猪瘟病毒核酸标准物质，以推进猪瘟病毒核酸分子检测标准化及我国猪瘟病毒体外诊断试剂的量值溯源和检测结果一致化。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种冻干型猪瘟核酸标准物质的制备方法，包括如下步骤：(1)猪瘟病毒液的制备；(2)取步骤(1)制备的病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；(3)取步骤(2)得到的灭活病毒液和保护剂混合，冻干，获得猪瘟病毒核酸标准物质。所述步骤(1)依次可包括如下步骤：(1-1)培养PK-15细胞；(1-2)接种猪瘟病毒并培养；(1-3)反复冻融；(1-4)离心，收集上清液，即为含有猪瘟病毒的病毒液。步骤(1-1)中，所述PK-15细胞具体可为ATCC的产品。步骤(1-1)中，所述细胞培养方法可为37℃、5％CO2培养，培养24h～48h。步骤(1-1)中，所述培养的培养体系细胞培养结束浓度可为1×104～1×106cells/mL。步骤(1-2)中，所述接种的猪瘟病毒初始浓度为106TCID50/mL，所述培养的时间可为24h～72h直至细胞病变(CPE)达到70％～80％结束培养；进一步的，所述培养的时间具体为72h。步骤(1-3)中，所述反复冻融的次数为3次。步骤(1-4)中，所述离心具体可为3000r/min离心。所述步骤(2)中，所述灭活可为热灭活或化学灭活。所述热灭活的条件具体为56℃水浴处理4h。所述步骤(3)中，所述保护剂中含有明胶和蔗糖。进一步地，所述保护剂含有质量分数为5％的明胶和25％的蔗糖的水溶液，使用前需高温高压灭菌(116℃)20min。所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。所述冻干的参数可为：-10℃～-40℃冷冻4h～10h。所述冻干的参数具体可为：-10℃冻干10h。上述的制备方法，优选地，其还包括对按如上所述制备方法获得的猪瘟病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或其他病毒检验。所述病毒灭活检验可使用细胞病变检验。所述支原体检验可使用支原体培养实验。所述其他病毒检验可使用荧光PCR检测试剂盒，其他病毒检验包括对猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲变异株(PRRSVJXA1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲株(PRRSVLV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检测。如上所述的制备方法，还包括对猪瘟病毒核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。进一步地，所述均匀性评估的步骤为：将所述猪瘟病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，结果进行均匀性评估。优选地，所述均匀性评估的抽样方法可为抽取10～30个(如15个)猪瘟病毒核酸标准物质，每个取样3次。所述均匀性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用单因素方差分析方法进行均匀性评估。所述数字PCR方法采用的引物对如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，探针如SEQIDNO.3所示，扩增体系采用的引物对浓度各10μM，探针10μM；扩增程序为45℃15min；95℃2min；95℃15s，55℃1min，40个循环；98℃10min；12℃60min。所述稳定性评估的步骤为：将猪瘟病毒核酸标准物质进行抽样，对样品提取核酸，并使用数字PCR方法进行检测，计算平均值，进行稳定性评估。所述稳定性评估可为长期稳定性评估和短期稳定性评估。进行长期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在-20℃保存N1个月、N2个月、N3个月、N4个月或N5个月(N1-N5均为自然数且0≤N1-N5≤14)，抽取不少于2瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次。进行短期稳定性评估的抽样方法可为：将核酸标准物质在4℃、25℃、60℃保存1周、2周、4周，抽取不少于2瓶的猪瘟病毒核酸标准物质，每个样品检测次数不少于1次。所述稳定性评估可为根据抽样方法和检测次数，使用回归或T检验进行稳定性评估。如上所述的制备方法还包括将猪瘟病毒核酸标准物质进行定值；定值表示为标准值±扩展不确定度；由若干个独立实验室使用数字PCR方法分别检测2个以上均匀且稳定的猪瘟病毒核酸标准物质，得到特征值；然后对各个特征值进行统计处理，确定标准值；使用统计学方法计算扩展不确定度，包括均匀性评估中引起的不确定度、稳定性评估中引起的不确定度和定值中引起的不确定度。多个实验室合作定值，参与实验室的最小数目通常为6-8个。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：/n(1)猪瘟病毒液的制备；/n(2)取步骤(1)制备的病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；/n(3)取步骤(2)得到的灭活病毒液和保护剂混合，冻干，获得猪瘟病毒核酸标准物质。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒核酸标准物质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)猪瘟病毒液的制备；
(2)取步骤(1)制备的病毒液热灭活，得到灭活的病毒液；
(3)取步骤(2)得到的灭活病毒液和保护剂混合，冻干，获得猪瘟病毒核酸标准物质。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述热灭活为56℃处理4h。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述保护剂含有明胶和蔗糖。


4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述保护剂为含有质量分数为5％的明胶和25％的蔗糖的水溶液，使用前需灭菌。


5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述“将灭活的病毒液和保护剂混合”为1体积份灭活的病毒液和1体积份保护剂混合。


6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述冻干的参数为：-10℃～-40℃冷冻干燥4h～10h。


7.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对猪瘟病毒核酸标准物质进行病毒灭活检验和/或支原体检验和/或其他病毒检验。


8.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将步骤(3)得到的猪瘟核酸标准物质进行均匀性评估和/或稳定性评估。


9.如权利要求7所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯小宇，梅力，高晓龙，陈晨，王英超，郑淑芸，韦海涛，宋彦军，赵景义，王林，沈光年，罗伏兵，邓柏林，
申请(专利权)人：北京市动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：北京;11