用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒和塞尼卡谷病毒的三重荧光RT‑PCR检测试剂盒，提供了用于检测猪水泡病毒VP1、口蹄疫病毒5’UTR与猪塞尼卡谷病毒聚合酶3D基因的特异性引物对和MGB探针，以及包括它们的试剂盒和试剂盒使用方法。本试剂盒的原理是：以猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和猪塞尼卡谷病毒3D基因为分子标识，制备猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒三重荧光RT‑PCR检测试剂盒。本试剂盒可快速甄别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒，可为这三种重要的猪水泡性病毒病提供快速、准确的甄别技术和方法，为一类动物疫病口蹄疫和猪水泡病的诊断和净化提供有力的支撑，同时也为新发猪塞尼卡谷病的流行病学调查提供依托。

Triple fluorescent RT-PCR kit for identification of swine vesicular virus, foot-and-mouth disease virus and Seneca Valley virus

【技术实现步骤摘要】
用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒
本专利技术涉及一种检测猪水泡症状相关病毒的试剂盒，特别涉及一种用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，属于生物制品检测和诊断

技术介绍
猪水泡病（SwineVesicularDisease,SVD），又称为猪传染性水泡病，是一种由猪水泡病毒（SwineVesicularDiseaseVirus,SVDV）引起的传染病，SVDV属于小RNA病毒科肠道病毒属。临床症状为猪鼻颈部、舌面等处发生水泡等。与口蹄疫病毒具有相似的临床症状，通常很难通过临床诊断作出确诊，二者均被我国划分为一类动物疫病，具有严格的检疫防控措施。口蹄疫是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouthDiseaseVirus,FMDV）引起的，是偶蹄动物易感的一种急性传染病，可以引起猪、牛、羊等家畜发病，也可以感染70多种野生动物。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，主要包括七个血清型，A、C、O、Asia1和SouthernAfricanTerritories(SATs)1、2、和3型。在我国，该病被列为一类动物疫病和强制免疫计划疫病，在猪群中具有一定的感染情况。该病的检疫要求严格，处理措施明确，因此就要就对该病的诊断要及时准确，尤其要与其他水泡症状疾病进行鉴别诊断。塞尼卡谷病毒A（SenecaValleyvirus，SVV）是一种二十面体无囊膜单股正链不分节段的RNA病毒，是小RNA病毒科塞尼卡病毒属的唯一成员。SVV感染的猪会在鼻吻或口腔等黏膜交界处出现完整或破裂的小水泡，也可能出现跛行、冠状带和蹄壁周围发红或发热，出现溃疡性病变，病猪厌食、嗜睡等症状。2002年，在美国首次报道SVV，确认该病毒存在于PER.C6细胞培养物中，认为是细胞培养基的污染物。在对先前患有水泡症状的病猪保藏样品进行测序分析发现，自20世纪80年代，美国猪群中便存在该病毒。2002-2015年，猪感染SVV的病例只有在美国和加拿大零星发生，但自2015年下半年起，在美国、巴西、哥伦比亚、中国等相继出现了SVV感染猪的病例。2015年初，巴西有6个州报告了SVV感染的疫情。同年，美国中西部多个地区的猪群发生水疱性疫情，感染猪的鼻吻、蹄冠状带部位出现水疱样病变，偶见腹泻症状，病情急促，新生仔猪病死率达30%～70%。后经实验室病原学鉴别诊断，排除口蹄疫、猪水疱病和水疱性口炎等重要动物疫病，最终确诊为SVV感染。2015年5月，我国广东省也发生了SVV感染猪的疫情，其特征是鼻吻和蹄冠部出现明显水泡，发病母猪发热、厌食，产房仔猪急性死亡。2016年10月，泰国北部一猪场爆发SVV疫情。2017年初，我国福建和河南再次发生猪感染SVV的疫情。至此，SVV在我国猪群中明确存在，且有蔓延趋势。针对以上问题，为加强对猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的监测，急需建立一套能够同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的方法，为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的流行病学监测和早期预警提供强有力的技术支撑和储备。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，利用三重荧光RT-PCR技术，可快捷地甄别猪群中猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒。该试剂盒的机理是：以猪水泡病毒衣壳蛋白VP1基因中的保守序列为分子标识设计引物和MGB探针，同时，分别以口蹄疫病毒5’UTR基因和猪塞尼卡谷病毒3D基因中的保守序列为分子标识设计引物和MGB探针，建立猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒三重检测体系，最终组装成猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒。本专利技术通过以下技术方案来实现：用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，由A盒和B盒组成，A盒含有裂解液、1.5mLEppendorf管，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT反应液和PCR反应液；所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段，探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。进一步的，用于检测猪水泡病毒VP1基因的引物对及其探针序列如下：SVDV-F：5’-TGTCGATACCATTCATTG-3’SVDV-R：5’-CGTGTCTCATATATAGTGTC-3’SVDV-P：5’-FAM-CATCGGCAACGCATACAGCAT-BHQ1-MGB-3’其中FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；用于检测猪口蹄疫病毒5’UTR基因的引物对及其探针序列如下：FMDV-F：5’-CCGGTTAGTACTCTTAACAC-3’FMDV-R：5’-CGTAGAGCGTCGAACTAA-3’FMDV-P：5’-ROX-CTCCGCCTACTTGGTCGTCA-BHQ2-MGB-3’其中ROX为荧光基团，BHQ-2为淬灭基团；用于检测猪塞尼卡谷病毒3D基因的引物对及其MGB探针序列如下：SVV-F：5’-CTGGTTGGTACGGATTAC-3’SVV-R：5’-GGCAGGAGTCATCTTATAC-3’SVV-P：5’-HEX-CGCCACCTCATTGAAGTCCAG-BHQ1-MGB-3’其中HEX为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团。进一步的，A盒用于样本核酸的提取，室温保存；B盒用于RNA的逆转录和PCR扩增反应，-20℃保存。本专利技术的积极效果是：1．本专利技术提供了一种同时检测猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR试剂盒，应用本试剂盒可同时鉴定猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。相对于市场上其他核酸检测试剂，本试剂盒为猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的诊断、监测、防控与净化提供了快捷的检测工具，具有重要的实践意义。2．本专利技术试剂盒涉及的MGB-Taqman探针，回避了多重RT-PCR中探针、引物以及扩增产物之间干扰的问题。具体如下：首先，探针3’末端利用了本身不产生荧光的BHQ作为淬灭基团，具有灵敏度高且荧光背景低等优点；其次，探针3’末端偶联MGB可以与DNA中小沟结合，形成较为稳定的异源双链，提高Tm值10℃左右，从而增加了荧光RT-PCR检测方法的特异性；最后，MGB探针较短，一般长度约为14-20bp，尤其适用于变异序列较多的特异性识别，易于设计。同时，3’端的淬灭基团和报告基因的空间位置较近，将较大程度地提升检测结果的准确性以及分辨率。3．本专利技术无柱式核酸提取方法，操作快捷简单，且对实验仪器设备的要求较低，大大提高了检测效率和检测成本。此外，本试剂盒将RNA逆转录试剂和PCR反应试剂整合为RT反应液和PCR反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：由A盒和B盒组成，A盒含有裂解液、1.5 mL Eppendorf管，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT反应液和PCR反应液；所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段，探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。/n

【技术特征摘要】
1.用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：由A盒和B盒组成，A盒含有裂解液、1.5mLEppendorf管，B盒含有阳性对照、阴性对照、RT反应液和PCR反应液；所述PCR反应液中有3对引物和3个MGB探针，引物分别用于扩增猪水泡病毒VP1基因片段、口蹄疫病毒5’UTR基因片段和塞尼卡谷病毒3D基因片段，探针分别用于识别猪水泡病毒VP1基因、口蹄疫病毒5’UTR基因和塞尼卡谷病毒3D基因。


2.根据权利要求1所述的用于鉴别猪水泡病毒、口蹄疫病毒与塞尼卡谷病毒的三重荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：用于检测猪水泡病毒VP1基因的引物对及其探针序列如下：
SVDV-F：5’-TGTCGATACCATTCATTG-3’
SVDV-R：5’-CGTGTCTCATATATAGTGTC-3’
SVDV-P：5’-FAM-CATCGGCAACGCATACAGCAT-BHQ1-MGB-3’
其中FAM为荧光基团，BHQ-1为淬灭基团；
...

【专利技术属性】
技术研发人员：连凯琪，张杰，周玲玲，张明亮，宋玉伟，王国栋，张福良，关现军，王双山，
申请(专利权)人：安阳工学院，
类型：发明
国别省市：河南;41