一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备方法及应用。在本发明专利技术中，以两种量子点为荧光信号源，同时加入功能单体和亲水单体，以HAV和HBV为模板分别印迹在不同的载体上，洗脱模板后将得到的印迹聚合物混合，得到可同时检测这两种病毒的荧光传感器。该传感器同时结合亲水单体N‑异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)及功能单体丙烯酸锌的优点，实现了对HAV、HBV两种病毒的高特异性识别。由于量子点在结合不同浓度目标物后荧光猝灭程度不同，从而实现可视化检测。本发明专利技术提供的策略为病毒分子印迹同时检测多种类似病毒奠定了很好的基础，同时也具有临床治疗与诊断病毒性疾病的潜在能力。

Preparation and application of molecularly imprinted fluorescent sensor for simultaneous and visual detection of two viruses

【技术实现步骤摘要】
一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备方法及应用
本专利技术属于分析化学检测
，具体涉及一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备方法及应用。
技术介绍
分子印迹技术在病毒检测领域因其易于制备，具有较高的稳定性、灵敏度及选择性等优点得到了越来越多的关注与应用。然而，由于病毒尺寸越大，其自组装形成的结构越脆弱，印迹也越困难；同时，病毒分子印迹通常依赖于病毒表面的外壳结构的特异性识别，由于相似病毒外壳的结构单元也相似[Cumbo,A.,Lorber,B.,Corvini,P.F.X.,Meier,W.,Shahgaldian,P.Nat.Commun.2013,4,1925–1930.]，因此，同时捕获并识别多种不同的病毒在目前仍是非常大的挑战，很难实现多种相似病毒的同时检测。近年来，分子印迹技术在病毒检测领域的发展，为这一难题的突破提供了有力的手段。例如，通过在聚合物表面引入亲水基团或单体来增加印迹颗粒的亲水性，减少非特异性结合[Yang,Y.,Niu,H.,Zhang,H.,ACSAppl.Mater.Interface,2016,8,15741–15749.；Ma,Y.,Pan,G.,Zhang,Y.,Guo,X.,Zhang,H.,Angew.Chem.,Int.Ed.2013,52,1511–1514.]，通过金属配位辅助分子印迹实现更高的模板特异性识别能力[Liu,J.,Yang,K.,Deng,Q.,Li,Qi.,Zhang,L.,Liang,Z.,Zhang,Y.,Chem.Commun.,2011,47,3969–3971.]，通过智能材料分子印迹对特定刺激的响应敏感，实现对目标分子的选择性可逆捕获及释放[Pcuci,F.,Cirillo,G.,Curcio,M.,ExpertOpiniononDrugDelivery,2011,8,1379–1393.]等。作为功能单体，丙烯酸锌因其可以与目标物螯合形成六元环结构、对模板较高的识别能力而被广泛应用于分子印迹聚合物的构建[Yan,Y.J.,He,X.W.,Li,W.Y.,Zhang,Y.K.,Biosens.Bioelectron.2017,91,253–261.；Qin,Y.P.,Wang,H.Y.,He,X.W.,Li,W.Y.,Zhang,Y.K.,Talanta2018,185,620–627.]；N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)因其良好的热敏特性、低于临界溶液温度时良好的亲水性，被广泛地应用于智能型分子印迹的构建[Li,C.,Ma,Y.,Niu,H.,Zhang,H.,ACSAppl.Mater.Interfaces2015,7,27340–27350.]。因此，同时结合NIPAAm和丙烯酸锌的优点，用于构建一种新型分子印迹传感器，对于实现多种相似病毒的同时检测具有重要的意义。HAV和HBV是引发肝炎最常见的两种病毒，它们引起的临床症状基本相同，可相互感染并在患者体内共存，因此同时检测这两种病毒在临床治疗上具有重要的意义。本专利技术以这两种病毒为目标物进行研究，以两种量子点为不同的荧光信号源，分别在不同的载体上印迹不同的病毒，洗脱之后，再将得到的印迹聚合物混合，构建成可用于同时检测两种病毒的荧光传感器。本专利技术同时加入NIPAAm和丙烯酸锌，利用NIPAAm热敏特性促进模板的快速洗脱，利用其亲水特性及丙烯酸锌的金属配位作用共同增强对目标物的选择性识别。同时由于量子点在结合不同浓度目标物后会产生不同程度的荧光猝灭，所以得到的传感器可实现可视化检测。如图2所示，结果表明，本专利技术构建的传感器在实际测定中几乎互不干扰，能实现HAV及HBV的分别或同时检测，具有高选择性、高灵敏度、低检测限等优点。本专利技术提供的策略为病毒分子印迹的同时检测奠定了很好的基础，同时也具有临床治疗与诊断病毒性疾病的潜在能力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备方法，并将所述传感器应用于相似病毒分子的特异性识别与检测。本专利技术的目的通过如下技术方案实现。一种同时检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备及应用，其特征在于，该方法具有以下工艺步骤：(1)基于荧光量子点、金属配位作用及亲水单体的病毒分子印迹聚合物的制备：不同实验条件下得到红，绿两种荧光量子点R-CdTeQDs，G-CdTeQDs，通过原硅酸四乙酯(TEOS)水解将一层二氧化硅包裹在量子点周围，并嫁接C＝C以连接丙烯酸锌，通过亲水单体NIPAAm的亲水作用吸附病毒，并通过金属螯合作用在丙烯酸锌与病毒之间形成含锌的六元环配位结构以固定模板病毒，聚合完成后洗脱模板分子；(2)通过金属螯合作用和亲水单体降低非特异性结合：合成印迹载体材料后，加入功能单体丙烯酸锌、亲水单体NIPAAm组装到印迹材料表面，由于低临界溶解温度下NIPAAm处于亲水溶胀状态，排斥疏水基质降低非特异性吸附；丙烯酸锌与模板病毒通过配位作用形成含锌六元环配位结构，提高了对模板病毒的特异性识别能力；(3)病毒分子印迹荧光传感器的制备及应用：将两种印迹聚合物G-MIPs与R-MIPs以确定比例混合，加入模板病毒HAV和HBV，在优化的实验条件下吸附一段时间后，取其混合物于比色皿中，激发波长为370nm，发射波长为555nm(检测HAV)和655nm(检测HBV)，狭缝宽均为5.0nm，采用RF-5301PC荧光分光光度计测其荧光强度，构建一种新型的用于同时检测两种病毒的分子印迹荧光传感器。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)以丙烯酸锌为功能单体，通过金属螯合作用与病毒分子之间形成六元环，既能有利于模板分子的固定，又不妨碍模板分子的洗脱；(2)以NIPAAm为亲水单体，通过其表面的亲水基团对疏水物质的排斥降低非特异性吸附；(3)实验结果表明，所述病毒分子印迹荧光传感器对相似病毒HAV和HBV具有很高的特异性识别能力，能实现其同时检测，且具有较高的选择性和灵敏度，印迹效果令人满意；(4)以量子点为荧光信号源，基于结合目标物后的荧光猝灭在紫外光照射下可实现可视化检测；(5)所述传感器具有应用于多种相似目标物同时检测的潜在可能性，检测过程对操作人员的专业要求不高，具有临床治疗与诊断病毒性疾病的潜在能力。附图说明[图1](A)所述病毒分子印迹荧光传感器的制备流程图；(B)金属配位作用的示意图。[图2]混合G-MIPs/R-MIPs(A)没有添加病毒；(B)加入HAV；(C)加入HBV；(D)加入HAV和HBV的荧光强度图。[图3](A)G-CdTe(a)，G-CdTe@SiO2(b)，G-CdTe@SiO2C＝C(c)，G-MIP(d)G-NIP；(B)R-CdTe(a)，R-CdTe@SiO2(b)，R-CdTe@SiO2C＝C(c)，R-MIP(d)R-NIP粒子的傅里叶变换红外光谱图。[图4](A)G-CdTe@SiO2；(B)G本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备及应用，其特征在于：以两种不同量子点为荧光信号源，在其表面涂抹二氧化硅作为载体材料，金属螯合剂为功能单体，加入N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)增强特异性识别能力，分别在不同的载体上印迹不同的病毒，洗脱之后将得到的印迹聚合物混合，构建为可用于同时检测两种相似病毒的荧光传感器。/n

【技术特征摘要】
1.一种同时可视化检测两种病毒的分子印迹荧光传感器的制备及应用，其特征在于：以两种不同量子点为荧光信号源，在其表面涂抹二氧化硅作为载体材料，金属螯合剂为功能单体，加入N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)增强特异性识别能力，分别在不同的载体上印迹不同的病毒，洗脱之后将得到的印迹聚合物混合，构建为可用于同时检测两种相似病毒的荧光传感器。


2.所述病毒分子印迹荧光传感器的制备。


3.所述病毒分子印迹荧光传感器的应用。


4.根据权利要求1所述的印迹聚合物的制备，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成G-CdTeQDs/R-CdTeQDs，并在其表面涂抹一层SiO2作为印迹时的载体材料；
2)将1)所得的G-CdTeQDs/R-CdTeQDs乙烯基化；
3)在2)的基础上，加入功能单体、亲水单体、交联剂及模板病毒HAV、HBV，聚合完成后洗脱模板，分别得到HAV和HBV印迹的聚合物。


5.根据权力要求1所述，其特征在于，通过金属螯合作用及亲水作用提高印迹聚合物对模板分子的特异性识别能力。


6.根据权利要求1所述的病毒分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所用的载体材料，模板病毒分别为：在荧光量子点上涂抹的SiO2微粒、HAV与HBV混合溶液。


7.根据权利要求1所述，其特征在于，所用的功能单体、亲水单体分别为：丙烯酸锌、NIPAAm。
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【专利技术属性】
技术研发人员：蔡昌群，陈思宇，罗谅晖，陈小明，
申请(专利权)人：湘潭大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43